高毒力肺炎克雷伯菌實驗室檢測-2

hvKP特異性基因序列確認包括：hvKP相關毒力基因檢測、hvKP的高通量測序和質譜鑒定。

1. hvKP相關毒力基因檢測

hvKP相關毒力基因決定了hvKP的是否具有高毒力，其中peg344、iroB、iucA、rmpA和rmpA2這些毒力基因聯合鑒定可以準確區分hvKP和cKP，準確度可達95%以上，是鑒定hvKP的“金標準”。hvKP相關毒力基因的檢測一般采用PCR方法，有普通PCR或多重PCR，毒力基因檢測因時間短、可操作性強，臨床應用越來越廣泛。

具體操作過程：（1）細菌樣本收集：收集原始送檢樣本或細菌菌落，建議使用純菌落；（2）DNA抽提：使用煮沸法或嚴格按照商品化試劑盒說明書抽提DNA；（3）毒力基因的擴增檢測：hvKP試劑盒檢測靶標一般為常見的毒力基因，推薦選用至少包含血清型K1和K2、rmpA、rmpA2、iroB和iucA的試劑。

2. hvKP的二代測序（next generation sequencing，NGS）

采用NGS直接檢測菌株或原始樣本全基因組，再通過生物信息學手段識別pLVPK樣或pK2044樣毒力質粒，還可以識別莢膜合成基因座（K 基因座），快速確認hvKP。目前主流應用NGS的測序平臺Illumina測序的原理為邊合成邊測序，包含以下5個步驟：（1）基因組DNA抽提；（2）DNA文庫構建；（3）文庫構建完畢后上樣進行流動池吸附；（4）橋式PCR擴增；（5）測序。

3. 質譜鑒定

基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time-of- flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）主要利用質譜中的特征峰圖譜對細菌或真菌進行判別分類，目前已經在微生物檢驗領域尤其菌種鑒定中獲得良好的應用效果，還可以進一步用于細菌分型、細菌毒力檢測、微生物亞種水平鑒別以及耐藥檢測等。MALDI-TOF MS區分K1型hvKP的具體方法：在MALDI-TOF MS程序中測試支持向量機（SVM）的算法，對由SVM模型生成的興趣峰的接收器操作特征曲線的分析發現其可準確區分K1型和非K1型hvKP菌株。研究發現MALDI-TOF對K1型和非K1型hvKP鑒定的準確度分別為94.1%和90.0%。需要注意的是，MALDI-TOF MS方法最好與傳統的基因分型技術一起應用為早期快速診斷提供參考。