高毒力肺炎克雷伯菌實驗室檢測-1

hvKP是肺炎克雷伯菌的高毒力變種，具有高侵襲性和高致病性的特點，較經典肺炎克雷伯菌（cKP）更容易引發嚴重的侵襲性和播散性感染，如肝膿腫、膿毒血癥等。本篇內容根據《高毒力肺炎克雷伯菌實驗室檢測專家共識》整理。

一、鏡下及培養

臨床標本直接涂片、革蘭染色鏡檢，鏡下可見革蘭陰性桿菌，可見明顯莢膜。

培養：血瓊脂平板上可見大、黏稠、易融合成片的菌落；麥康凱上為粉紅色黏稠的菌落。hvKP可為有拉絲的菌落。

二、hvKP鑒定

1. 生化表型鑒定：hvKP與cKP生化表型鑒定幾無差別。

2. hvKP確認：當前臨床常用于檢測hvKP和評估毒力的方法包括表型和基因檢測。本篇僅學習表型檢測，下一篇內容學習基因檢測。

hvKP生物學活性（毒力）確認包括：拉絲試驗、莢膜分型、鐵載體檢測和毒力表型檢測。

拉絲試驗：

使用接種環豎直向上輕輕蘸起血瓊脂平板上的單個菌落，菌落拉絲長度≥5 mm為拉絲試驗陽性，提示具備高黏液表型。提示：需要注意的是，研究發現高毒力和中毒力菌株之間黏度表型并無顯著性差異，說明拉絲試驗并不能作為檢測hvKP和評估毒力強弱的靈敏方法及確診的指標，僅可作為hvKP的生物學特征之一。

莢膜分型：

（1）免疫學方法：基于莢膜K抗原的傳統血清學分型應用最為廣泛，但血清交叉反應會對結果判斷有一定影響。莢膜血清型在hvKP的生物學鑒定中有一定的參考價值，一些莢膜血清型（如K1、K2、K5、K20和K54等）在hvKP中占很大的比例。

（2）分子生物學方法：wzi分型，采用PCR技術可在短時間內擴增出大量莢膜結構相關基因片段，擴增出莢膜聚合酶基因wzi，測序后上傳序列至數據庫（https：//bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl？db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=query）進行比對，得到菌株K型，這是一種快速簡便的篩查方法。

鐵載體檢測：鐵載體是鑒別cKP和hvKP的重要指標。

檢測方法：（1）定性分析：制備含有鉻天青S染料的檢測培養基，37 ℃下過夜孵育后，菌落周圍形成不透明的金黃色區域，表明產生了高水平的鐵載體。（2）定量分析：制備不同濃度鐵載體的標準品和鐵載體分析液，反應混合物培養30 min后在630 nm處測量OD值，繪制標準曲線并計算鐵載體含量，濃度報告單位為g/L，≥0.03 g/L能較強烈預測為hvKP。

毒力表型檢測：

（1）中性粒細胞殺菌活性試驗：以中性粒細胞與細菌共孵育后（殺菌試驗后）細菌存活率表示hvKP菌株的毒力強弱，細菌存活率=［加中性粒細胞共孵育的實驗組的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）/不加中性粒細胞共孵育的對照組CFU］×100%。

（2）血清抗性實驗：將細菌與正常人血清（normal human serum，NHS）混合，37 ℃培養3 h。細菌存活率=（使用血清細菌懸液CFU/無NHS的細菌懸液CFU）×100%。