一起來(lái)了解PCR反應(yīng)中用到的添加劑！

在 PCR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于科研、臨床檢測(cè)等領(lǐng)域的今天，引物設(shè)計(jì)的合理性是反應(yīng)成功的基礎(chǔ)，但體系優(yōu)化同樣關(guān)鍵。為提升擴(kuò)增特異性、保護(hù)酶活性、減少非特異產(chǎn)物，各類功能明確的 PCR 添加劑逐漸成為體系優(yōu)化的核心工具。這些添加劑通過(guò)調(diào)控 DNA 結(jié)構(gòu)、清除反應(yīng)干擾、穩(wěn)定關(guān)鍵酶類等機(jī)制，為 PCR 反應(yīng)的高效進(jìn)行保駕護(hù)航。深入理解其作用原理與應(yīng)用邊界，是科研工作者實(shí)現(xiàn)反應(yīng)性能突破的重要前提。

一、降低非特異性擴(kuò)增：精準(zhǔn)靶向的核心添加劑

PCR 反應(yīng)中，非特異性擴(kuò)增往往源于引物錯(cuò)配、模板二級(jí)結(jié)構(gòu)或溫度波動(dòng)引發(fā)的非特異結(jié)合，兩類添加劑通過(guò)不同機(jī)制針對(duì)性解決這一問(wèn)題。

甲酰胺：調(diào)控 DNA 穩(wěn)定性，壓制非特異擴(kuò)增

甲酰胺作為一種無(wú)色清澈的有機(jī)溶劑，其化學(xué)特性使其成為 PCR 體系中調(diào)控 DNA 結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵試劑。它能夠與 DNA 雙螺旋的大溝、小溝區(qū)域結(jié)合，破壞堿基間的氫鍵與疏水相互作用，直接降低 DNA 的解鏈溫度。這一特性讓 DNA 在更低溫度下即可完成解鏈，為引物與模板的特異性結(jié)合創(chuàng)造條件，同時(shí)有效減少引物錯(cuò)配導(dǎo)致的非特異擴(kuò)增，顯著提升反應(yīng)效率。

實(shí)際應(yīng)用中，甲酰胺的常用濃度控制在 1%~5%。值得注意的是，使用時(shí)需充分考量其與反應(yīng)體系其他成分的相互作用，避免因成分干擾削弱整體反應(yīng)效果，需結(jié)合具體實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景進(jìn)行濃度優(yōu)化。

TMAC：強(qiáng)化雜化特異性，穩(wěn)定反應(yīng)溫度窗口

四甲基氯化銨（TMAC）憑借獨(dú)特的電荷作用機(jī)制，成為提升 PCR 特異性的重要選擇。它與 DNA 鏈上的負(fù)電荷基團(tuán)發(fā)生相互作用，形成一層電荷屏蔽層，有效削弱 DNA 鏈間的靜電斥力，讓引物與模板的結(jié)合更趨穩(wěn)定。這一特性不僅能在較高退火溫度下維持引物 - 模板的特異性結(jié)合，還能提升 DNA 的解鏈溫度，減少因溫度波動(dòng)引發(fā)的非特異擴(kuò)增。

TMAC 的常用濃度范圍為 15~100mM，具體數(shù)值需通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定。其在簡(jiǎn)并引物參與的反應(yīng)中表現(xiàn)尤為突出，能有效彌補(bǔ)簡(jiǎn)并引物特異性不足的短板，為復(fù)雜模板的擴(kuò)增提供支持。

二、蛋白質(zhì)類添加劑：保障反應(yīng)精準(zhǔn)性的關(guān)鍵助力

蛋白質(zhì)類添加劑通過(guò)結(jié)合雜質(zhì)、保護(hù)核酸或抑制非特異相互作用，從多個(gè)維度保障 PCR 反應(yīng)的精準(zhǔn)進(jìn)行。

BSA：清除抑制雜質(zhì)，提升反應(yīng)穩(wěn)定性

牛血清白蛋白（BSA）是 PCR 體系中應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)類添加劑，其分子量約 66.46KDa，憑借豐富的氨基酸殘基與疏水基團(tuán)，展現(xiàn)出多重功能。它能特異性結(jié)合反應(yīng)體系中的酚類化合物等抑制劑與雜質(zhì)，避免這類物質(zhì)影響 DNA 聚合酶的活性與穩(wěn)定性；同時(shí)可減少反應(yīng)物在管壁的附著，提升反應(yīng)底物的利用率，進(jìn)而提高擴(kuò)增產(chǎn)量。

BSA 的常規(guī)使用濃度約為 0.8mg/ml，實(shí)際應(yīng)用中需根據(jù)模板純度、反應(yīng)體系組成等因素調(diào)整，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定最佳濃度，確保其充分發(fā)揮作用而不產(chǎn)生副作用。

TthSSB：保護(hù)單鏈 DNA，規(guī)避非特異結(jié)構(gòu)

耐熱單鏈結(jié)合蛋白（TthSSB）的核心作用聚焦于單鏈 DNA（ssDNA）的保護(hù)。在 PCR 反應(yīng)的解鏈階段，瞬時(shí)形成的 ssDNA 易受核酸酶攻擊，且可能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)影響引物結(jié)合，TthSSB 能特異性結(jié)合這些 ssDNA，既抵御核酸酶的降解，又能抑制二級(jí)結(jié)構(gòu)形成，從源頭減少非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生，為引物與模板的正常結(jié)合掃清障礙。

BT：抑制引物二聚體，優(yōu)化引物利用效率

牛凝血酶（BT）的獨(dú)特價(jià)值在于針對(duì)性抑制引物二聚體的形成。引物二聚體是 PCR 反應(yīng)中常見(jiàn)的非特異產(chǎn)物，會(huì)消耗引物與反應(yīng)資源，降低目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。BT 通過(guò)調(diào)控引物間的相互作用，阻止其非特異性結(jié)合形成二聚體，確保引物能高效參與與模板的結(jié)合反應(yīng)，提升目標(biāo)擴(kuò)增的效率與純度。

三、多功能補(bǔ)充添加劑：完善體系的 “輔助軍團(tuán)”

除核心功能添加劑外，一系列補(bǔ)充類添加劑從保護(hù)酶活性、促進(jìn)反應(yīng)啟動(dòng)、維持體系穩(wěn)定等角度，進(jìn)一步優(yōu)化 PCR 反應(yīng)效果。

海藻糖：保護(hù)聚合酶活性，抵御熱變性影響

海藻糖在 PCR 體系中的核心作用是保護(hù) DNA 聚合酶。PCR 反應(yīng)的高溫循環(huán)易導(dǎo)致聚合酶熱變性失活，海藻糖能在蛋白熱變性過(guò)程中維持其骨架結(jié)構(gòu)，有效防止 DNA 聚合酶變性；同時(shí)還能抵御血液中的抑制物干擾，減少酶蛋白在玻璃器皿表面的附著，為聚合酶創(chuàng)造穩(wěn)定的工作環(huán)境，保障反應(yīng)持續(xù)高效進(jìn)行。

亞精胺：促進(jìn)復(fù)合物形成，加速反應(yīng)啟動(dòng)

亞精胺通過(guò)調(diào)控反應(yīng)關(guān)鍵組分的相互作用發(fā)揮增益效果。它能促進(jìn) DNA 聚合酶、引物與模板三者的結(jié)合，助力 PCR 起始復(fù)合物快速形成，從反應(yīng)啟動(dòng)階段提升擴(kuò)增效率，讓目標(biāo)片段的擴(kuò)增更迅速、更充分，尤其適用于模板濃度較低或擴(kuò)增難度較大的反應(yīng)體系。

甘油與丙二醇：調(diào)控 Tm 值，穩(wěn)定酶類活性

甘油與丙二醇作為兼具多重功能的添加劑，在 PCR 體系中發(fā)揮雙重作用。一方面，二者能降低引物的解鏈溫度（Tm 值），適配不同退火溫度需求的反應(yīng)；另一方面，它們能有效防止 DNA 聚合酶在高溫循環(huán)中變性，維持酶的催化活性，為反應(yīng)的穩(wěn)定性提供保障，是通用性較強(qiáng)的體系優(yōu)化試劑。

DTT：抗氧化護(hù)酶，維持反應(yīng)環(huán)境

二硫蘇糖醇（DTT）作為強(qiáng)效還原劑，其核心功能是抗氧化保護(hù)。PCR 反應(yīng)過(guò)程中，氧化環(huán)境可能導(dǎo)致聚合酶變性失活，DTT 通過(guò)清除體系中的活性氧，保護(hù)聚合酶免受氧化損傷，維持其穩(wěn)定的催化活性，為反應(yīng)的順利進(jìn)行提供穩(wěn)定的化學(xué)環(huán)境。

PCR enhancer：復(fù)合增效劑，謹(jǐn)慎適配場(chǎng)景

PCR enhancer 并非單一成分，而是由 DMSO、甜菜堿、TMAC、海藻糖等多種添加劑復(fù)配而成的混合物。它通過(guò)協(xié)同作用降低 DNA 的 Tm 值或增強(qiáng) Taq DNA 聚合酶的穩(wěn)定性，全面提升 PCR 反應(yīng)效率。但需特別注意，這類復(fù)合添加劑可能會(huì)降低 PCR 反應(yīng)的保真度，因此在高保真 PCR 實(shí)驗(yàn)中需謹(jǐn)慎使用，避免影響擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。

在 PCR 體系優(yōu)化中，添加劑的選擇并非 “多多益善”，而是需要結(jié)合引物特性、模板質(zhì)量、擴(kuò)增目標(biāo)及反應(yīng)條件精準(zhǔn)匹配。不同添加劑的作用機(jī)制存在差異，盲目組合可能引發(fā)成分間的相互干擾，反而影響反應(yīng)效果。

對(duì)于科研工作者而言，深入理解各類 PCR 添加劑的作用原理與應(yīng)用邊界，是實(shí)現(xiàn)反應(yīng)效率與特異性雙重提升的關(guān)鍵。合理運(yùn)用這些優(yōu)化工具，不僅能解決常規(guī) PCR 反應(yīng)中的非特異、低產(chǎn)等問(wèn)題，更為復(fù)雜樣本（如含抑制物、低豐度模板）的擴(kuò)增提供了更多解決方案，為科研與檢測(cè)工作的順利推進(jìn)提供有力支撐。