革蘭氏染色
革蘭氏染色法最初由漢斯·克里斯蒂安·格拉姆（Hans Christian Gram）在1884年使用。格拉姆當時正在尋找一種方法，使肺炎的患者肺部組織切片中的球菌能夠被顯影。當時，羅伯特·科赫（Robert Koch）設計了一種用于顯影結核桿菌的染色方法。格拉姆設計了一種以結晶紫（龍膽紫）為主要染色劑，以碘溶液為媒染劑，再用乙醇作為脫色劑進行處理的方法。這種染色方法使組織樣本中的真核細胞不被染色，而肺炎患者肺部的球菌則被染成藍紫色。格拉姆發現，他的染色方法可以顯影一系列與疾病相關的細菌，例如“猩紅熱后化膿性關節炎的球菌（鏈球菌）”。然而，他發現，傷寒桿菌在加入乙醇后，用結晶紫和碘處理后很容易褪色。我們現在知道，那些被革蘭氏染色劑染成藍色/紫色的細菌是革蘭氏陽性菌，包括肺炎鏈球菌（存在于肺炎患者的肺部）和化膿性鏈球菌（來自猩紅熱患者），而那些褪色的細菌則是革蘭氏陰性菌，例如傷寒沙門氏菌。
該技術的改良階段體現了科學研究的接力協作。格拉姆的原始方法僅包含初染、媒染、脫色三步，未能使脫色后的陰性菌顯色，這一關鍵缺陷在數年后由德國病理學家Carl Weigert通過引入沙黃復染步驟得以彌補，從而形成了如今完整的四步染色法（初染-媒染-脫色-復染），使未保留紫色的細菌呈現紅色，實現了革蘭陽性與陰性菌的清晰區分。
在19世紀細菌分類學初創期，革蘭氏染色技術的定型為微生物學研究提供了關鍵工具。當時微生物學正致力于建立病原菌與疾病的關聯，該技術憑借對細菌細胞壁特性的差異化染色能力，成為細菌分類的重要依據，直接推動了“病原菌-疾病關聯”認知的深化。盡管格拉姆本人未獲得諾貝爾獎，但其開創的技術經過后續研究者的完善，最終成為醫學微生物學的標準操作流程，至今仍在細菌鑒定、感染性疾病診斷中發揮核心作用。
生物學機制
革蘭氏染色流程
革蘭氏染色法是細菌學中最廣泛使用的染色程序，是一種復雜且具有區分性的染色程序。通過一系列染色和脫色步驟，根據細胞壁的組成對微生物進行區分。革蘭氏陽性菌的細胞壁含有厚厚的一層肽聚糖(占細胞壁的90%，10-80nm左右)，染色后會呈現紫色。革蘭氏陰性細菌的細胞壁則含有薄薄的一層肽聚糖(占壁的10%，2-10nm左右)，且脂質含量較高。這些細菌染色后會呈現粉色。由于古細菌和真核生物均缺乏肽聚糖，因此這種染色方法不適用于它們。進行革蘭氏染色時，需要遵循四個基本步驟:首先，將熱固定后的涂片進行初染(使用結晶紫);其次，加入媒染劑(革蘭氏碘液);接著，用酒精、丙酮或酒精和丙酮的混合物進行快速脫色;最后，用番紅進行復染。
化學機制
結晶紫（Crystal Violet）
關于革蘭氏染色化學機制已在1983年由戴維斯等人得到確定。在水溶液中，結晶紫分解為CV+和CL-離子，這些離子能夠穿透革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁和細胞膜。CV+與細菌細胞中的負電荷成分相互作用，使細胞呈現紫色。當加入碘(I-或者I3-）時，它與CV+結合，在細胞質和細胞外層形成大型CVI復合物。脫色劑(乙醇或乙醇和丙酮溶液)與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞膜脂質發生相互作用。革蘭氏陰性菌的外膜從細胞上脫落，使肽聚糖層暴露出來。革蘭氏陰性菌具有一到三層較薄的肽聚糖層，其結構與革蘭氏陽性菌的肽聚糖稍有不同。經過乙醇處理，革蘭氏陰性菌的細胞壁變得有滲透性，從而使得大型CVI復合物能夠從細胞中被洗脫。革蘭氏陽性細胞高度交聯的多層肽聚糖在加入乙醇后被脫水。肽聚糖的多層結構與乙醇處理導致的脫水作用共同作用，將大型 CVI復合體困在細胞內。脫色后，革蘭氏陽性細胞仍保持紫色外觀，而革蘭氏陰性細胞則失去紫色，在帶正電荷的染料番紅后才會顯現出來。在革蘭氏染色完成時革蘭氏陽性細胞呈紫色，而革蘭氏陰性細胞則為粉色至紅色。
革蘭氏染色鏡檢圖（左圖為G?，右圖為G?）
一些細菌在革蘭氏染色后呈現出所謂的“革蘭氏可變”模式，目即可見到粉色和紫色的混合細胞。某些屬，如放線菌屬、關節桿菌屬、棒狀桿菌屬、分枝桿菌屬和丙酸桿菌屬，其細胞壁在細胞分裂過程中特別容易破裂，導致這些革蘭氏陽性細胞呈現出革蘭氏陰性染色。此外，在所有使用革蘭氏染色法染色的細菌中，培養的年齡可能會影響染色結果。之前的文章對此現象進行過詳細分析革蘭氏染色中的“變色龍”。
結果判讀與質量控制
革蘭氏染色的典型結果可通過顯微鏡觀察直接判定：革蘭氏陽性菌（G?）因細胞壁肽聚糖層較厚，經結晶紫初染和碘液媒染后形成的復合物不易被乙醇脫色，故鏡下呈紫色或藍紫色；革蘭氏陰性菌（G?）細胞壁肽聚糖層薄且脂質含量高，乙醇處理后細胞壁通透性增加，復合物被洗脫，復染后呈紅色或粉紅色。為確保染色結果的可靠性，需引入“質控菌株”概念，即通過同步染色已知特性的標準菌株作為對照。通常以大腸桿菌（G?，桿狀紅色）作為陰性對照，金黃色葡萄球菌（G+，球狀紫色）作為陽性對照，若質控菌株染色結果符合預期，方可判定待檢樣本結果有效。
常見問題與解決措施
涂片過厚
脫色劑
目前可以采用多種脫色劑(丙酮、丙酮/乙醇、乙醇)，丙酮是最快速的脫色劑，其次是丙酮/乙醇，最后是乙醇。建議使用乙醇，以防止樣品過度脫色。
脫色時間
脫色時間控制不當是另一關鍵問題，具體分為脫色過度與脫色不足。脫色過度（如超過30秒）會破壞革蘭陽性菌細胞壁肽聚糖層，導致結晶紫-碘復合物洗脫，使陽性菌誤染為陰性；脫色不足（如少于20秒）則無法充分溶解革蘭陰性菌細胞壁脂類，造成陰性菌誤染為陽性。解決措施為嚴格控制脫色時間在20-30秒，操作時需觀察至無紫色液體流出，且冬季可適當延長、夏季縮短以適應環境溫度影響。
菌齡
技術局限性
革蘭氏染色技術在臨床應用中存在多方面技術局限性，其結果易受操作規范性、細菌生物學特性及標本條件等因素影響，可能導致假陽性或假陰性結果。在操作與培養條件方面，假陽性可因培養時間不足、細菌混合污染、死亡自溶、染色操作不當（如脫色不充分）、實驗室污染或細菌處于芽孢狀態等引發；假陰性則常與脫色過度、菌齡過長（培養物需<24小時，肉湯培養需先離心）相關。此外，涂片制備問題、觀察者經驗誤差等也可能導致結果異常。為彌補上述不足，實踐中需采用“形態學+分子生物學”聯合策略：通過革蘭氏染色進行初步分類后，結合細菌培養、生化試驗、PCR鑒定種屬等等方法，可顯著提升診斷準確性。
結語
盡管分子生物學技術迅猛發展，革蘭氏染色憑借其獨特的實用性和不可替代性，依然在微生物研究與診斷中占據核心地位。其“簡便、快速”的優勢無法被復雜的分子方法完全取代，而未來通過與自動化技術、分子診斷手段的結合，其準確性與應用范圍將進一步拓展。
