正交法測定幾種因素對酶活力的影響
一、實驗目的
1．初步掌握正交法(正交試驗設計法)的使用。
2．運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度和pH 值這四種因素對酶活力的影響。
二、實驗原理
酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如酶濃度、底物濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響酶催化的反應速度。通常在其他因素恒定的條件下，通過某一因素在一系列變化條件下的酶活力測定求得該因素的影響，這是單因素的試驗方法。對于多因素的試驗可以通過正交試驗設計法(簡稱正交法)來完成。正交法是借助于正交表，簡化表格計算，正確分析結果．找到實驗的最佳條件、分清因素的主次，這樣就可以通過比較少的實驗次數達到好的實驗效果。
本實驗運用正交法測定底物濃度、酶濃度、溫度、pH 值這四個因素對酶活性的影響，并求得在什么樣的底物濃度、酶濃度、溫度和pH 值時酶的活力最大。
三、儀器、原料和試劑
儀器
試管及試管架、恒溫水浴箱、小漏斗及濾紙、分光光度計 、吸量管、小漏斗及濾紙、 pH 計。
原料
牛血清白蛋白、牛胰蛋白藥。
試劑
1. 牛血清白蛋白：20mL 蒸餾水中加入牛血清白蛋白2.2g，尿素36g，1mol/LNaOH 溶液8mL，室溫放置1h，使蛋白質變性。如有不溶物，可過濾除去。再加0.2 mol/LNaH2PO4溶液至110mL 及尿素4g，調節溶液pH 達7.6左右。
2. 蛋白酶液：3mg 牛胰蛋白酶冷凍干粉，溶于10mL 蒸餾水。
3. 15％三氯乙酸溶液：15g 三氯乙酸溶于蒸餾水．并稀釋至100mL。
4. lmol/LpH 7、8、9巴比妥緩沖液
5. Fo1in-酚甲試劑
① 4％碳酸鈉溶液；
②0．2％氫氧化鈉溶液；
③1％硫酸銅溶液；
④2％酒石酸鉀鈉溶液
臨用前將①與②等體積配制碳酸鈉氫氧化鈉溶液。②與④等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后把這兩種試劑按50：1的比例混勻。即成Folin—酚甲試劑。此試劑臨用而配制，一天內有效。
6. Folin—酚乙試劑
向2L 容積的磨口回流瓶中加入100g 鎢酸納(NaWO4·2H2O)，25g 鉬酸鈉(NaMoO4H2O)及700mL蒸餾水，再加人85％磷酸50mL 及濃鹽酸100mL，充分混和后，接上回流冷凝管，以小火回流10h(燒瓶內加小玻璃珠數顆，以防止溶液沸溢)?；亓鹘Y束后再加入150g 硫酸鋰(Li2SO4)，50mL 蒸餾水及液溴數滴，然后開口繼續沸騰15min，以驅除過量的溴，冷卻后溶液呈鮮黃色(如仍呈綠色，須再重復滴加溴水的步驟)，冷卻后加蒸餾水定容至1000mL，過濾，即成Folin—酚乙試劑，濾掖置于棕色試劑瓶中，可在冰箱內長期保存。若此儲存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸數分鐘，恢復原色仍能繼續使用。
Folin—酚乙試劑儲存液在使用前使酸度最終為1moL／L?？捎脴藴蔔aOH 溶液(1mol/L 左右)，以酚酞作指示劑，當溶液顏色由紅一紫色一紫－灰墨綠時即為滴定終點。該試劑儲存液的酸度應為2moL/L 右，將之稀釋至相當于1moL/L，酸度便可使用。
7. 0.1mol/LNaH 2PO4溶液
8. 尿素
9. 1mol/LNaOH 溶液
四、操作步驟
(一)實驗設計
1.確定試驗因素和水平
本實驗取四個因素，即底物濃度
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