凝膠過濾法分離蛋白質
一、實驗目的：
1、學習凝膠柱層析 技術的原理及操作方法；
2、學習血紅蛋白的制備方法。
二、實驗原理:
1.凝膠層析：原理與應用
2.本實驗反應原理：血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是紅細胞的主要內含物，它是血紅素和珠蛋白肽鏈聯接而成的一種結合蛋白，屬色素蛋白。血紅蛋白(Mw＝64 500)中加入過量的高鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血紅蛋白與高鐵氰化鉀反應生成高鐵血紅蛋白(MetHb)。為了除去多余的高鐵氰化鉀，得到較純的MetHb樣品，將上述混合物通過交聯葡聚糖凝膠柱，用磷酸緩沖液洗脫，從顏色的不同，可直接觀察到MetHb(紅褐色)洗脫較快，而小分子 高鐵氰化鉀(黃色)洗脫較慢，達到將MetHb完全分離出來的目的。
二、實驗材料、試劑和儀器:
(一)材料：雞的抗凝全血
(二)試劑：
1．四氯化碳(CCl4)
2．生理鹽水
3．交聯葡聚糖G-25(細粒)
4．0.1mol/L磷酸緩沖液 (pH7.0)：
a、0.1M磷酸二氫鈉；b、0.1M磷酸氫二鈉；
a、b以49:51的比例混合，并用pH計校對
5．0.4% K3Fe(CN)6。
6. 冷生理鹽水
(三)儀器(略)
三、實驗步驟：
．凝膠的處理：
取4克Sephadex-G25干粉，浸泡于蒸餾水中充分溶脹（室溫，6小時），然后傾斜法除去表面懸浮的小顆粒，最后加入等體積pH7磷酸緩沖液繼續浸泡。
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