用溫度敏感型啟動子表達系統表達目的基因
實驗目的
1. 掌握將目的基因插入表達載體中表達目的蛋白的技術路線和試驗流程。
2. 了解通過誘導重組DNA表達目的基因的技術。
實驗原理
P L P R 啟動子是大腸桿菌l噬菌體中控制早期轉錄的啟動子，具有極強的起始RNA轉錄的功能，基因工程中常用它來構建高效表達載體，它受抑制物CI蛋白的負調控。在實際中CI蛋白被改造成溫度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp長）編碼。CIts在30℃時具有抑制啟動子的活性，在42℃時失活而失去抑制啟動子的活性，因此，改變工程菌的培養溫度即可控制目的基因的表達，這一點比用誘導劑誘導表達的系統要節省操作步驟和成本，在大規模基因表達中優點尤其明顯。有些表達載體本身帶有CIts857片段，能自身編碼CIts蛋白，對宿主的選擇范圍較寬；另一些表達載體自身不帶CIts857片段，選擇宿主茵時，要求宿主是有缺陷的原噬菌體溶源化的菌株（如M5219)，前一類載體表達效率往往更高。
將IL基因以5’端 Eco RI和3’端 Bam HI酶切位點插入pBV220載體多克隆位點中，轉化到大腸桿菌JMl03內，便能通過溫度的變換控制CI蛋白的活性，繼而調節啟動子的活性，使IL基因連同其5’端上游帶SD序列轉錄成mRNA并轉錄終止于rrnB位點，SD序列與ATG的間距為6bp，mRNA作為模板使核糖體高效翻譯出IL產物。
實驗材料和試劑
（一）實驗材料
1．載體：pBV220為中國預防醫學科學院病毒學研究所構建。
2．質粒pUCl8-IL。
3．大腸桿菌JMl03。
（二）培養基
l．LB液體培蕎基，LB固體培養基（同實驗一）。
2．加氨芐青霉素（Amp）的LB固體培蕎基（同實驗一）。
（三）試劑
1．酶類： Eco RI、 Bam HI、T 4 DNA連接酶。
2．DNA回收試劑盒。
（四） 儀器
PCR自動擴增儀 微量移液器
離心機 電泳儀
水平電泳槽 透射紫外觀察儀
實驗步驟
1．用 Eco RI和 Bam HI酶切pBV220（1mg）（酶切方法見實驗四），pBV220經純化后待用。
2．用 Eco RI和 Bam HI酶切pUCl8-IL DNA（4mg），酶切好的600bp IL DNA片段用DNA回收 試劑 盒回收待用。
3．取0.2mg酶切好的pBV220載體加0.2mg 的600bp IL DNA片段，用T4DNA連接酶連接（見實驗五）。
4．取連接產物轉化JMl03感受態菌，涂布于加Amp的LB固體培養基上。
5．快速抽提質粒；酶切鑒定重組質粒。
6．用接種環取重組克隆于3ml 含50 mg/ml Amp的LB液體培養基的150×15mm試管中，斜置于30℃恒溫搖床，200r/min培養過夜。
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