生物芯片技術(shù)
生物芯片技術(shù) 是近年來興起的一項綜合性的高新技術(shù)，它以微機電系統(tǒng)技術(shù)和生物技術(shù)為依托，將生命科學(xué)研究中的許多不連續(xù)過程（如樣品制備、生化反應(yīng)、檢測等步驟）集成并移植到一塊普通郵票大小的芯片上去，并使這些分散的過程連續(xù)化、微型化，以實現(xiàn)對大量生物信息進行快速、并行處理的要求。
生物芯片概念的提出受到了計算機芯片的啟發(fā)。狹義的生物芯片是指包埋在固相載體（如硅片、玻璃和塑料等）上的高密度ＤＮＡ、蛋白質(zhì)、細胞等微陣列芯片，如ｃＤＮＡ微陣列、寡核苷酸 微陣列和蛋白質(zhì)微陣列等。這些微陣列由生物活性物質(zhì)以點陣的形式有序地固定在固相載體上形成。在一定的條件下進行生化反應(yīng)，將反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)熒光法、酶標法、電化學(xué)法顯示，然后用專用的生物芯片掃描儀或電子信號檢測儀采集數(shù)據(jù)，最后通過專門的計算機軟件進行數(shù)據(jù)分析。廣義的生物芯片是指任何能對生物分子進行快速并行處理和分析的微型固體薄型器件。
自從１９９１年福多爾（Ｓ． Ｐ． Ａ． Ｆｏｄｏｒ）等人提出ＤＮＡ芯片至今，以ＤＮＡ芯片為代表的生物芯片技術(shù)已經(jīng)得到了快速的發(fā)展。目前生物芯片技術(shù)除了ＤＮＡ芯片技術(shù)外，還包括免疫 芯片分析技術(shù)、芯片核酸擴增技術(shù)、細胞芯片分析技術(shù)和以芯片為平臺的高通量藥物篩選技術(shù)等。這些新興技術(shù)的出現(xiàn)將為生命科學(xué)研究、疾病診斷與治療、新藥開發(fā)、國防、司法鑒定、食品衛(wèi)生檢驗、航空航天等領(lǐng)域帶來一場革命。正是由于生物芯片技術(shù)的飛速發(fā)展，美國科學(xué)促進協(xié)會將其評為１９９８年科技十大突破之一。
樣品制備芯片
生物樣品往往是復(fù)雜的混合物，在大多數(shù)情況下需要先對生物樣品進行預(yù)處理，即樣品制備。以核酸樣品制備為例，它包括了細胞分離、破胞、脫蛋白、提取ＤＮＡ等多步工作。這些工作可以在樣品制備芯片上完成。目前在細胞分離方法上較突出的有過濾分離和介電電泳分離等；芯片中的破胞方法有芯片升溫破胞、高壓脈沖破胞以及化學(xué)破胞等。
過濾分離芯片
過濾分離即根據(jù)生物顆粒的尺寸差異進行分離。針對人白細胞的分離，１９９８年美國賓夕法尼亞大學(xué)的研究小組研究出了一種芯片微過濾法。芯片微過濾器的工作原理是根據(jù)人白細胞的尺寸比紅細胞大的特點，使人外周血流過微過濾器時只讓血漿和尺寸較小的紅血細胞及血小板通過，而截住尺寸較大的白細胞。加工微過濾用芯片是通過在硅片上刻出各種形狀的過濾通道，通道直徑為幾個微米，然后再在硅芯片上鍵合上一塊玻璃蓋片而完成。通過反復(fù)試驗和設(shè)計，微芯片過濾器已從最初的豎式Ｚ形結(jié)構(gòu)，通過豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)過渡最后定型為橫壩式結(jié)構(gòu)。采用橫壩式結(jié)構(gòu)的優(yōu)點是人白細胞的回收率高，過濾器不易被堵塞。微芯片過濾器的另一應(yīng)用是它可將孕婦外周血中極少量的胎兒細胞過濾出來，供下一步作產(chǎn)前診斷之用。
介電電泳分離芯片
介電電泳分離的原理是細胞在高頻不均勻電場作用下產(chǎn)生極化，不同的細胞由于介電特性、電導(dǎo)率、形狀不同而感應(yīng)出不同的偶電極，因此受到不同介電力的作用。利用介電電泳方法制備樣品的優(yōu)點是：通過測量細胞的運動速度，可以得到細胞的介電特性；可以對細胞進行無物理接觸的選擇性操縱、定位、分離。
生化反應(yīng)芯片
生化反應(yīng)芯片的目的是把在實驗室試管中進行的生化實驗縮微到一塊小小的芯片上。目前較典型的生化反應(yīng)芯片包括聚合酶鏈反應(yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃ-ｔｉｏｎ，ＰＣＲ）芯片、藥物合成芯片等，其中ＰＣＲ擴增芯片是生化反應(yīng)芯片的典型代表。
在芯片上進行ＰＣＲ擴增反應(yīng)的背景是，目前在生物芯片領(lǐng)域中所用的檢測儀器靈敏度還不夠高，所以從血液或活體組織中提取的ＤＮＡ在標記或應(yīng)用前都需要擴增復(fù)制。例如，在對一個腫瘤的活體解剖樣品進行檢測時，需要在幾千個正常基因中找到一個異常的癌基因，顯然這需要對樣品ＤＮＡ進行必要的擴增復(fù)制才易于檢測。ＰＣＲ作為生物學(xué)中最常用的ＤＮＡ擴增手段，由變性、延伸、退火三個步驟所構(gòu)成，其每個步驟的工作溫度大約分別為９５℃、７２℃、６０℃。通過該反應(yīng)可將極微量的ＤＮＡ成千上萬倍地擴增，以滿足實驗需要。
除了上述方法外，另一個更簡易的方法是將帕爾帖器件（一種可通過改變器件兩端電壓的極性而產(chǎn)生加熱或致冷效果的半導(dǎo)體器件），直接貼在ＰＣＲ擴增芯片的背面，人們只需控制帕爾帖器件的溫度在三個恒溫區(qū)之間變化，就能在芯片上實現(xiàn)ＰＣＲ擴增。
檢 測 芯 片
檢測芯片主要包括毛細管電泳芯片和微陣列芯片兩類。
毛細管電泳芯片
毛細管電泳（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ）對于ＤＮＡ測序、司法鑒定、ＰＣＲ產(chǎn)物分析來說是一個強有力的手段。與平板凝膠電泳相比，毛細管電泳能更快速、更準確地分離ＤＮＡ片段，這是因為可以在毛細管兩端加上更高的電壓。毛細管電泳的缺點是一次只能分析一個樣品，毛細管微陣列電泳將平板凝膠電泳和毛細管電泳兩種方法的優(yōu)點結(jié)合起來，在毛細管微陣列上并行地進行電泳，它能增大電泳泳道數(shù)目、提高電泳速度，是一種有著巨大應(yīng)用前景的方法。
在毛細管電泳的基礎(chǔ)上，近幾年發(fā)展出集成度更高的集成毛細管電泳技術(shù)。集成毛細管電泳技術(shù)是在硅、玻璃、塑料等基體上刻蝕出毛細管槽，用蓋板封閉好后，在毛細管中填入媒體，使電泳分離的整個過程集成到一塊幾平方厘米的基片上。集成毛細管電泳芯片具有高效、快速、試樣用量少等優(yōu)點，并已經(jīng)在免疫測定、ＤＮＡ分析和測序、氨基酸和蛋白質(zhì)分析、生物細胞研究方面得到應(yīng)用。
伍利（Ａ． Ｔ． Ｗｏｏｌｌｅｙ）等人報道的方法，利用光刻掩膜和化學(xué)刻蝕技術(shù)在玻璃基底上光刻出微通道陣列，然后使基底與另一塊玻璃片鍵合構(gòu)成毛細管陣列，其中上層玻璃片上鉆有小孔作為樣品輸入孔。ＤＮＡ片段在緩沖液中被熒光標記，最后利用激光共焦熒光探測系統(tǒng)檢測毛細管電泳的結(jié)果。
拉加利（Ｅ． Ｔ． Ｌａｇａｌｌｙ）等人構(gòu)建了一種將ＰＣＲ反應(yīng)和毛細管電泳集成在一起的ＰＣＲ－ＣＥ器件。他們將熱循環(huán)所需的加熱元件直接微加工在器件上，升溫／降溫的速度為每秒１０℃，每一次ＰＣＲ熱循環(huán)的時間為３０秒，利用５０納升容量的微閥和疏水性出口將樣品輸運到２００納升容量的ＰＣＲ反應(yīng)腔中。基于該集成化ＰＣＲ－ＣＥ器件，能夠?qū)崿F(xiàn)對單個ＤＮＡ分子的擴增和檢測。
此外劉英杰等人還構(gòu)建了一種基于聚碳酸酯材料的集成毛細管器件來分析ＤＮＡ樣品。他們利用壓模方法加工出毛細管微通道，聚碳酸酯材料在鍵合前接受了紫外線輻射以增強親水性。實驗表明該器件能顯著區(qū)分長度為１００個堿基對、２００個堿基對……１５００個堿基對等的ＤＮＡ片斷。
微陣列芯片
ＤＮＡ微陣列芯片基于ＤＮＡ雜交反應(yīng)的原理，先將許多ＤＮＡ片段末端固定在芯片上，然后讓熒光標記的樣品核酸通過流路或加樣至芯片上，雜交反應(yīng)結(jié)束后清洗芯片，留在芯片上的樣品核酸即可用熒光檢測的方法來檢測。由于ＤＮＡ微陣列芯片不要求先對基底做微細加工，因此可利用自動化或化學(xué)合成方法在基底上直接施加或合成生化物質(zhì)。目前有４種典型的ＤＮＡ微陣列芯片制備方法：光引導(dǎo)原位合成法、接觸式點涂法、化學(xué)噴射法、壓電噴射原位合成法。
光引導(dǎo)原位合成法是將微電子工業(yè)中的光刻技術(shù)與ＤＮＡ的光化學(xué)合成方法相結(jié)合。首先把用光敏保護基團保護的４種核苷酸固定在玻片上，然后根據(jù)設(shè)計要求用不同的掩模板對玻片進行掩蔽，光照處的光敏保護基團分解，暴露的地方即可加上新的被保護的核苷酸，如此循環(huán)下去就能以很高的密度和精度來制備ＤＮＡ微陣列芯片。現(xiàn)在人們已經(jīng)能在１．６厘米２的玻片上合成４０萬組寡核苷酸。這種方法的缺點是需要花費大量的時間和成本來制備掩模板，因為寡核苷酸的每個堿基位需要４塊掩模板，合成一個２５個堿基對的微陣列芯片就需要１００塊掩模板。
接觸式點涂法先將ＤＮＡ探針合成好，然后通過一個點接觸裝置自動地將探針點到玻片上的指定地點。點接觸法的優(yōu)點是快速、經(jīng)濟、多功能，缺點是每種樣品都必須是合成好、經(jīng)過純化并事先保存的。
化學(xué)噴射法是以定滴供給的方式，通過壓電晶體或其他推進形式從噴嘴內(nèi)將生物樣品噴射到玻璃基片上。噴射法所需的樣品是已經(jīng)合成好的ＤＮＡ，它與點接觸法的區(qū)別是噴嘴不與玻片接觸。
壓電噴射原位合成法主要包括兩個步驟：先在直徑為７５毫米的二氧化硅基底上制備高密度的小坑，每個小坑的直徑為１００微米，間距３０微米，共約１０萬個小坑，小坑內(nèi)作羥基化親水處理，小坑間作氟化疏水處理，這樣得到的小坑即可作為ＤＮＡ合成的微型反應(yīng)池；然后根據(jù)實際要求，在４個壓電噴頭中分別裝入Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ核苷酸，由計算機控制微陣列ＤＮＡ芯片ｘ－ｙ方向的運動，將４種核苷酸噴射到適當?shù)男】又校纱嗽陬A(yù)制的基底上并行合成出微陣列ＤＮＡ芯片。
生物芯片中的微流體技術(shù)
在生物、化學(xué)、材料等科學(xué)實驗中，經(jīng)常需要對流體進行操作，如樣品ＤＮＡ的制備、ＰＣＲ反應(yīng)、電泳檢測等操作都是在液相環(huán)境中進行。如果要將樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測等步驟集成到生物芯片上，則實驗所用流體的量就從毫升、微升級降至納升或皮升級，這時功能強大的微流體裝置就顯得必不可少了。因此隨著生物芯片技術(shù)的發(fā)展，微流體技術(shù)作為生物芯片的一項關(guān)鍵支撐技術(shù)也得到了人們越來越多的關(guān)注。
與微電子技術(shù)不同，微流體技術(shù)不強調(diào)減小器件的尺寸，它著重于構(gòu)建微流體通道系統(tǒng)來實現(xiàn)各種復(fù)雜的微流體操縱功能。與宏觀流體系統(tǒng)類似，微流體系統(tǒng)所需的器件也包括泵、閥、混合器、過濾器、分離器等。盡管與微電子器件相比，微通道的尺寸顯得相當大，但實際上這個尺寸對于流體而言已經(jīng)是非常小。微通道中的流體流動行為與人們在日常生活中所見的宏觀流體流動行為有著本質(zhì)的差別，因此微泵、微閥、微混合器、微過濾器、微分離器等微型器件往往都與相應(yīng)的宏觀器件差別甚大。
為了精確設(shè)計微流體系統(tǒng)中所需的器件，首先要確定微通道中流體的流動性質(zhì)。現(xiàn)在人們利用共焦顯微鏡成像技術(shù)可以方便地對微通道中的流動過程進行量化，達到了以往無法實現(xiàn)的高分辨率。世界上第一個微流體器件由英國帝國理工大學(xué)（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ）的曼齊（Ａ． Ｍａｎｚ）、美國橡樹嶺國家實驗室的拉姆齊（Ｍ． Ｒａｍｓｅｙ）等科學(xué)家在１９９０年代初研制成功。該器件是利用常規(guī)的平面加工工藝（光刻、腐蝕等）在硅、玻璃上制作的。盡管這種制作方法非常精密，但成本高，且不靈活，無法適應(yīng)研發(fā)需求。最近懷特賽茲（Ｇ． Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）等人提出一種“軟光刻”微加工方法，即在有機材料上印制、成型出微結(jié)構(gòu)，從而能方便地加工原型器件和專用器件。另外這個方法還能構(gòu)建出三維微通道結(jié)構(gòu)，并能在更高層次上控制微流體通道表面的分子結(jié)構(gòu)。
噴射技術(shù)是最成熟的微流體技術(shù)，它使用直徑小于１００微米的孔來產(chǎn)生微滴。這項技術(shù)可用于輸運微反應(yīng)中的微量試劑，以及將微量ＤＮＡ樣品分發(fā)到載體表面形成微陣列（參見ＤＮＡ芯片制作中的化學(xué)噴射法、壓電噴射原位合成法）。前面提到的集成毛細管電泳技術(shù)也是近幾年出現(xiàn)的另一項微流體技術(shù)。
生物芯片的光學(xué)檢測和數(shù)據(jù)處理
對ＤＮＡ芯片上所包含的信息進行準確檢測是一項至關(guān)重要的工作。早期的方法是同位素標記法，應(yīng)用時需經(jīng)過曝光、顯影，然后用具有尋址功能的掃描儀掃讀。目前在生物芯片信息采集中使用最多最成功的是熒光標記法，這種方法不受同位素的使用限制，用激光作為激發(fā)光源的共焦掃描裝置具有極高的靈敏度、分辨能力和定位功能，并能定量地輸出結(jié)果。
最近納馬西瓦亞姆（Ｖ． Ｎａｍａｓｉｖａｙａｍ）等人構(gòu)建了一種將熒光檢測裝置直接集成在生物芯片上的方法，這更加提高了生物芯片的集成度。他們在硅上加工出光電二極管，并與芯片上的微流體系統(tǒng)相結(jié)合，可以實現(xiàn)０．９納克／微升的ＤＮＡ檢測精度，信噪比為１００∶１。
由于利用生物芯片可以一次性地得到大量實驗數(shù)據(jù)，因此需要一個專用的軟件系統(tǒng)來處理數(shù)據(jù)。完整的生物芯片數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，應(yīng)該包括芯片圖像分析和數(shù)據(jù)提取，芯片數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析和生物學(xué)分析，芯片的數(shù)據(jù)庫積累和管理，芯片表達基因的國際互聯(lián)網(wǎng)檢索，表達基因數(shù)據(jù)庫分析和積累等功能。
生物芯片應(yīng)用
在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用
研究表明，在不同的組織中表達基因的數(shù)目差別非常大，腦中基因表達的數(shù)目最多，約有３～４萬個，而有的組織中只有幾十個基因表達。不能準確知道每種組織中表達基因的數(shù)目以及每個基因的表達量，就無法從分子水平上了解這一組織在生命活動中的功能。另外同一組織在不同的生長發(fā)育階段中基因表達的種類、數(shù)量也不同，有些基因是在幼年期表達的，而有些基因是在老年期表達的。因此人們不但需要了解基因的序列，還要了解基因在不同組織、不同時間中基因的表達譜，這引發(fā)了功能基因組學(xué)的誕生。
功能基因組學(xué)研究的是在特定組織中、發(fā)育的不同階段或者是疾病的不同時期基因的表達情況，因此它要求能在同一時刻獲得多個分子遺傳學(xué)分析的結(jié)果；另外，任何一個細胞中都會有上千個基因在表達。而細胞間基因表達的差異往往能反應(yīng)出這些細胞是正常發(fā)育還是在朝惡性腫瘤細胞方向發(fā)展。采用生物芯片技術(shù)利用核酸雜交對基因表達進行并行分析的好處是，它用很少的細胞物質(zhì)便能提供有關(guān)多基因差異表達的信息，從而給功能基因組學(xué)研究提供前所未有的信息量。
作為超高通量藥物篩選平臺的應(yīng)用
在過去的十多年中，隨著科技的不斷進步以及在巨大的經(jīng)濟利益驅(qū)使下，藥物篩選技術(shù)得到了很大的發(fā)展。在１９８０年代中期，每天只能篩選３０種化合物，到了１９９０年代中期，每天可篩選１５００種化合物，而如今每天可篩選超過１０萬個化合物。高速、低成本的高通量篩選已經(jīng)成為當今藥物篩選的主流，并逐漸向超高通量方向發(fā)展。要進一步提高篩選效率，目前的高通量篩選技術(shù)在各方面均需要技術(shù)創(chuàng)新，這為生物芯片技術(shù)進入藥物篩選領(lǐng)域提供了寶貴的契機。
實現(xiàn)超高通量篩選有兩條途徑：微型化和自動化。生物芯片作為一種新型技術(shù)平臺，正可滿足超高通量篩選的微型化、自動化需要。
在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用
對藥物進行毒性評價，是藥物篩選過程中十分重要的一個環(huán)節(jié)。現(xiàn)在毒理學(xué)家多采用小鼠作為模型，通過動物實驗來確定藥物的潛在毒性。這些方法需要使用大劑量的藥物，花幾年的時間，代價巨大。ＤＮＡ芯片技術(shù)可將藥物毒性與基因表達特征聯(lián)系起來，通過對基因表達情況的分析來確定藥物毒性，使得藥物毒性或其他不希望出現(xiàn)的效應(yīng)在臨床實驗前得以確認。用ＤＮＡ芯片可以在一個實驗中同時對成千上萬個基因的表達情況進行分析，從而可為研究化學(xué)分子或藥物分子對生物系統(tǒng)的作用提供全新的線索。
該技術(shù)可對單個或多個有害物質(zhì)進行分析，確定化學(xué)物質(zhì)在低劑量條件下的毒性，分析推斷有毒物質(zhì)對不同生物的毒性可比性。如果不同類型的有毒物質(zhì)所對應(yīng)的基因表達譜有特征性的規(guī)律，那么通過比較對照樣品和有毒物質(zhì)的基因表達譜，就可以對各種有毒物質(zhì)進行分類。在此基礎(chǔ)上通過進一步建立合適的生物模型系統(tǒng)，便可通過基因表達譜的變化來反映藥物對人體的毒性。
雖然生物芯片技術(shù)是一項新興的技術(shù),但是由于其巨大的應(yīng)用前景，它已經(jīng)成為各國工業(yè)界和學(xué)術(shù)界競相研究的熱點。隨著生物芯片制作工藝和檢測分析手段的不斷進步，可以預(yù)期在不遠的將來，生物芯片技術(shù)將滲透到生命科學(xué)研究、疾病診斷與治療、新藥開發(fā)、國防、司法鑒定、食品衛(wèi)生檢驗、航空航天等各個領(lǐng)域中去，成為科學(xué)家探索未知世界奧秘的有力武器。
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