選擇性凋亡DNA LADDER抽提試劑盒的應(yīng)用

一、背景

選擇性凋亡DNA LADDER抽提試劑盒選擇性從組織和細(xì)胞中分離提取凋亡DNA ladder，通過(guò)選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，最大限度的減少了基因組DNA對(duì)凋亡DNA ladder的觀察干擾，因此顯著提高了檢測(cè)敏感度。反應(yīng)可在微量離心管進(jìn)行，2.5小時(shí)完成，快速方便；無(wú)需有機(jī)抽提，檢測(cè)靈敏度J高，可從約2000個(gè)凋亡細(xì)胞中檢測(cè)到DNA ladder。推薦起始細(xì)胞量為5-10x105個(gè)，但投入的細(xì)胞量可在1x105~5 x106之間變化。

原則是總細(xì)胞中應(yīng)含有至少約1-2x104個(gè)凋亡細(xì)胞。多于2x104個(gè)凋亡細(xì)胞通常可獲得十分清晰的凋亡DNA ladder。本試劑盒也可用于從組織中提取凋亡DNA ladder。但與培養(yǎng)細(xì)胞相比，整體動(dòng)物組織凋亡細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間、部位、程度等規(guī)律性差往往造成難以準(zhǔn)確取材，可能顯著影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細(xì)胞一個(gè)形態(tài)學(xué)的顯著特點(diǎn)是染色體DNA以核小體為單位（185bp）規(guī)律斷裂形成長(zhǎng)度約為n x 185bp(n=1,2,3,4...）的DNA片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示為階梯狀凋亡DNA Ladder，是凋亡細(xì)胞最直觀的特征。

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過(guò)程中普遍存在的、由基因決定的細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡方式。當(dāng)細(xì)胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時(shí)，啟動(dòng)基因調(diào)控的自殺保護(hù)措施，去除體內(nèi)非必需細(xì)胞或即將發(fā)生特化的細(xì)胞。在這一過(guò)程中，細(xì)胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細(xì)胞自主死亡，包含一系列信號(hào)事件組成的通路。

細(xì)胞凋亡失調(diào)與多種疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。

細(xì)胞凋亡通過(guò)特征性的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化而區(qū)別于壞死(Necrosis)，包括細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核皺縮、核膜核仁破碎等等。在正常活細(xì)胞中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡(jiǎn)稱PS)位于細(xì)胞膜的近細(xì)胞質(zhì)面。而在凋亡細(xì)胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細(xì)胞表面即細(xì)胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細(xì)胞外部。在白細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，白細(xì)胞表面的PS標(biāo)記可以被巨噬細(xì)胞識(shí)別，從而最終被巨噬細(xì)胞吞噬。

二、應(yīng)用

用于Rbm14在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的功能研究：

選擇性剪接是由反式作用RNA結(jié)合蛋白結(jié)合到mRNA前體轉(zhuǎn)錄本的順式作用元件上調(diào)控的。剪接小體作為介導(dǎo)mRNA前體剪接的核心反式作用元件,由5個(gè)小核RNAs和多種RNA結(jié)合蛋白因子組成的。除了剪接小體,其他輔助性RNA結(jié)合蛋白,尤其是RNA識(shí)別基序（RNA Recognition Motif,RRM）,也參與了時(shí)空特異性選擇性剪接事件的調(diào)控。RBM14是一種RNA結(jié)合蛋白,參與多種細(xì)胞功能和生物過(guò)程,比如轉(zhuǎn)錄共激活、紡錘體組裝、病毒感染和干細(xì)胞分化等。

最近研究也報(bào)道了RBM14在小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse Embryonic Stem Cells,mESCs）的多能性維持和中胚層分化中發(fā)揮重要作用。然而,RBM14在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育中的體內(nèi)功能還不清楚。在成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9）和胚胎顯微注射技術(shù)的介導(dǎo)下,我們得到了Rbm14單等位基因敲除小鼠,并將其雌雄小鼠進(jìn)行交配。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Rbm14雙等位基因敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎致死。

進(jìn)一步的組織學(xué)分析表明,Rbm14敲除會(huì)導(dǎo)致上胚層細(xì)胞凋亡和mESCs細(xì)胞凋亡,以致小鼠胚胎發(fā)育阻滯在原腸胚階段。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),RBM14參與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)基因的選擇性剪接,敲除RBM14會(huì)導(dǎo)致這些基因發(fā)生異常的選擇性剪接,并造成mESCs中DNA損傷的積累。因此,研究發(fā)現(xiàn),在小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,RBM14通過(guò)調(diào)控與DDR相關(guān)基因的選擇性剪接,在維持基因組DNA完整性中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。

研究中的關(guān)鍵新發(fā)現(xiàn)包括：（1）Rbm14雙等位基因敲除,造成小鼠早期胚胎致死。（2）Rbm14雙等位基因敲除后,引起著床后胚胎上胚層細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育中原腸運(yùn)動(dòng)紊亂。（3）Rbm14敲除,導(dǎo)致在mESCs中DNA損傷的積累。（4）RBM14與可變剪接因子相互作用,通過(guò)選擇性剪接調(diào)控DDR相關(guān)基因。

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