熒光標記DNA探針在細胞核混懸液雜交中的應用
（1）細胞核的分離：將培養(yǎng)的細胞制成細胞混懸液，或以胰蛋白酶消化法于培養(yǎng)蓋上收集培養(yǎng)細胞。應用MgSO4染色分離方法分離細胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 ）。細胞混懸液濃度為5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核從細胞分離，細胞核混懸液濃度為4～5×106細胞核/ml。
（2）細胞固定和酸的處理：在5 ml試管內(nèi)加冷的100%酒精不斷旋轉(zhuǎn)以達到滿意的固定。在冰上停留10 min。在4 ℃離心（×150 g）10 min。重復加三次冷的100%酒精入試管內(nèi)，離心，傾去。置于冰上10 min，再離心。然后加入相當核懸液1/2量的0.1 n HCl , 0.5% Triton X-100。
室溫停留10 min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50 mmol/l KCl, 10 mmol/L MgSO4, 5 mmol/L HEPES pH8.0）。再離心，重復IBM漂洗（這時細胞核可在不染色情況下，以熒光顯微鏡觀察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5 mmol/l MgSO4。在室溫靜置站立10 min。
傾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，離心，使細胞核混懸液最終濃度為108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍，在血球計數(shù)器計數(shù)），混懸液鏡檢應含單個，完整的細胞核。
（3）細胞核混懸液雜交
①配制雜交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH調(diào)至7.0。此原液（stock solution）可貯存在4 ℃冰箱內(nèi)。應用時加1份10 mg/ml鯡魚精子DNA（herring sperm DNA）。
②混合1 μl的細胞核混懸液（108/ml）與18 μl的雜交混合液，充分混勻。將此19 μl混合液移入1.5 ml容積的Eppendorf 管中（核含量約為105）。
③加入100 ng/每管的AAF標記DNA探針（如為生物素標記DNA探針濃度為20～40 ng/每管）。
④置70 ℃10 min使DNA探針和核DNA變性。
⑤和組織切片與DNA探針雜交方法相較，不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應，而應迅速轉(zhuǎn)入37 ℃孵育過夜。
（4）雜交后漂洗
在每管中加入1.25 ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42 ℃靜置10～15 min。偶爾旋轉(zhuǎn)以助混勻。冷卻至室溫。加100 μl經(jīng)dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細胞（107/ml）混勻，離心，室溫，10 min，輕彈試管使沉淀的小塊散開，加入1.25 ml 2×SSC(pH7.0)，42 ℃，繼之，靜置于室溫10～15 min，如前離心，再加1.25 ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5 min，離心。
注：DEMS處理紅細胞方法：經(jīng)漂洗并離心去除白細胞和血清的紅細胞在鹽液如PBS中，細胞含量為108/ml，以K2CO3和DEMS溶液處理3次，第1次：K2CO3為20 mmol/L,DEMS為3 mmol/L，以后2次：K2CO3依然為20 mmol/L，而DEMS為10 mmol/L。
在應用前將K2CO3和DEMS液混合加入紅細胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應用100 mmol/l K2CO3將pH調(diào)至9～10。在25 ℃，15 min后，加入50 μl，100 mmol/l 的檸檬酸（citric acid）/每ml細胞混懸液的濃度以達固定紅細胞的目的。
固定的紅細胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到108/ml，加0.1%疊氮鈉可在4 ℃保存至少1年。
（5）AFF標記的熒光顯示：加200 μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），輕輕振蕩混勻，室溫靜置10 min，加20 μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37 ℃孵育45 min，加1.25 ml的PBS-Tween，室溫靜置10 min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200 μl PBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20 μl的羊抗小鼠–FITC熒光標記抗血清，稀釋度1：100～1：300。
孵育于37 ℃ 45 min，加1.25 ml PBS –Tween,室溫靜置10 min，離心，傾去上清液。
（6）生物素標記探針的熒光顯示：加200 μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10 min后，加20 μl抗生物素標記FITC抗血清15 μg/ml，孵育在37 ℃ 30 min，以1.5 ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25 ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10～15 min，間歇振蕩、離心。
（7）熒光顯微鏡觀察：將細胞核混懸液稀釋于250 μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細胞核涂片上，選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長觀察。
（8）流式細胞計：將750 μl的細胞核混懸液通過流式細胞儀（Flow cytometry, FCM），DEMS處理過的紅細胞作為對照（Df 530/30 nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。
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