分光光度技術：基本原理及應用
有色溶液對光線有選擇性的吸收作用，不同物質由于其分子結構不同，對不同波長線的吸收能力也不同，因此，每種物質都具有其特異的吸收光譜。有些無色溶液，光雖對可見光無吸收作光光度技術吸收用，但所含物質可以吸收特定波長的紫外線或紅外線。分光譜來鑒定物質性質及含量的技術，其理論依據是(分光光度法)主要是指利用物質特有的Lambert和Beer定律。
分光光度法是比色法的發展。比色法只限于在可見光區，分光光度法則可以擴展到紫外光區和紅外光區。比色法用的單色光是來自濾光片，譜帶寬度從40－120nm，精度不高，分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過3－5nm，在紫外區可到1nm以下，來自棱鏡或光柵，具有較高的精度。
基本原理
一、光的基本知識
光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續的微粒和連續的波動性。波長和頻率是光的波動性和特征，可用下式表示：
式中λ為波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長。Ｖ為頻率，即每秒鐘振動次數。Ｃ為光速等于299770千米／秒。光屬于電磁波。自然界中存在各種不同波長的電磁波，列成表1-1所示的波譜圖。 分光光度法所使用的光譜范圍在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之間。其中200nm－400nm為紫外光區，400nm－760nm為可見光區，760nm－10,000nm為紅外光區。
二、朗伯－比爾（Lambert-Beer）定律
朗伯－比爾定律是比色分析的基本原理，這個定律是有色溶液對單色光的吸收程度與溶液及液層厚度間的定量關系。此定律是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。
1.朗伯定律
一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強度就要減弱：若溶液濃度不變，則溶液的厚度愈大（即光在溶液中所經過的途徑愈長），光的強度減低也愈顯著。
2.朗伯－比爾定律
如果同時考慮吸收層的厚度和溶液濃度對光吸收的影響，則必然將朗伯定律和比爾定律合并起來，吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比，這就是朗伯－比爾定律。
分光光度計基本結構簡介
能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強度的 儀器 稱為 分光光度計 。
分光光度計 因使用的波長范圍不同而分為紫外光區、可見光區、紅外光區以及萬用（全波段）分光光度計等。無論哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測器系統。如圖1-1所示。
一、光源
要求能提供所需波長范圍的連續光譜，穩定而有足夠的強度。常用的有白熾燈（鎢比燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、 氘燈 及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。
鎢燈和鹵鎢燈發射320－2000nm連續光譜，最適宜工作范圍為360－1000nm，穩定性好，用作可見光分光光度計的光源。氫燈和 氘燈 能發射150－400nm的紫外結，可用作紫外光區分光光度計的光源。紅外線光源則由納恩斯特（Nernst）棒產生，此棒由ＺrＯ2:Ｙ2Ｏ3=17:3（Ｚr為鋯，Ｙ為釔）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2（Ｇe為鈰）及ＴhＯ2
（Ｔh為釷）之混合物制成。汞燈發射的不是連續光譜， 能量絕大部分集中在253.6nm波長外，一般作波長校正用。 鎢燈 在出現燈管發黑時應及更換，如換用的燈型號不同，還需要調節燈座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英的，且有固定的發射方向，安裝時必須仔細校正接觸燈管時應戴手套以防留下污跡。
二、分光系統（單色器）
單色器是指能從混合光波中分解出來所需單一波長光的裝置，由棱鏡或光柵構成。用玻璃制成的棱鏡色散力強，但只能在可見光區工作，石棱鏡工作波長范圍為185￣4000nm，在紫外區有較好的分辯力而且也適用于可見光區和近紅外區。 棱鏡的特點是波長越短，色散程度越好，越向長波一側越差。所以用棱鏡的分光光度計，其波長刻度在紫外區可達到0.2nm，而在長波段只能達到5nm。有的分光光系統是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，刻線處不透光，于是通過光的干涉和衍射現象，較長的光波偏折的角度大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜。
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