親和層析法純化胰蛋白酶粗液的方法步驟
解析蛋白酶活性測定 聚焦蛋白酶研究新進(jìn)展
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1.熟悉親和層析 純化蛋白質(zhì)的的原理。
2.初步掌握親和層析 法純化胰蛋白酶的方法步驟。
二、實(shí)驗(yàn)原理
親和層析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原 、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等，也可用于分離細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等。近十多年來，親和層析發(fā)展十分迅速，尤其是對那些分離流程長、難度大、濃度低、雜質(zhì)多，采用常規(guī)方法難以進(jìn)行分離的生物分子來說，親和層析顯示出其獨(dú)特的優(yōu)越性。
親和層析主要是根據(jù)生物分子與特定的固相化配基之間的親和力而使生物分子得到分離。它是由吸附層析衍生、發(fā)展起來的分離技術(shù)。利用親和層析載體 固相化配基與親和互補(bǔ)物之間通過范德華力、疏水力、靜電力、氫鍵作用等發(fā)生專一性的結(jié)合而進(jìn)行分離。這種有選擇性地結(jié)合主要?dú)w結(jié)于固相化配基與親和互補(bǔ)物二者之間的生物學(xué)特性和特異的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及空間構(gòu)象。在親和層析過程中，被純化的生物分子在一定的條件下，選擇性地結(jié)合到被共價偶聯(lián)到不溶性載體上的配基上，然后改變原有的條件，如洗脫液的PH 值、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑的濃度等，有選擇性地從載體上把被分離物洗脫下來。通過親和層析法分離的物質(zhì)，其純度、活性回收率及純化倍數(shù)均較高。
親和層析的載體 要選用機(jī)械強(qiáng)度高、非特異性吸附少、水不溶性的、具有較多化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)—羥基的多糖類介質(zhì)，該載體在溫和條件下與配基共價偶聯(lián)，而又不影響配基及被分離物質(zhì)原有的生物學(xué)特性。
1967年P(guān)orath 和Ernback 報道了采用溴化氰可將含有氨基的有機(jī)分子偶聯(lián)到多糖基上，使得親和層析技術(shù)向前推進(jìn)了一大步。直到目前，溴化氰活化載體還是用得最多，效果最好的活化方法。1971年P(guān)orath 又報道了應(yīng)用環(huán)氧氯丙烷在堿性條件下活化載體的方法，克服溴化氰由于劇毒給操作帶來的不便，使活化載體的方法簡便易行，親和層析技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。
目前可用于活化載體的活化劑有幾十種之多，但常用的是溴化氰、環(huán)氧氯丙烷、1.4—丁二醚、戌二醛等。采用環(huán)氧氯丙烷為活化劑，sepharose 4B 為載體，雞卵類粘蛋白為配基可合成適用于分離胰蛋白酶的親和吸附
劑。載體活化及偶聯(lián)反應(yīng)如下：
1. 環(huán)氧氯丙烷活化載體與配基偶聯(lián)
2. 溴化氰活化載體與配基偶聯(lián)
上述反應(yīng)，除了氨基能偶聯(lián)外，也能與巰基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。
另一種與配基的偶聯(lián)方式是插入”手臂”。在親和層析中如果要以一個小分子作為配基(如胺類)，而被分離物(親相互補(bǔ)物)又是一個大分子，二者在結(jié)合過程中就會受到空間阻礙，影響結(jié)合效果。因此，必須在載體和配基之間引入一段”手臂”，即再接上一段有機(jī)分子，使載體上的配基向外擴(kuò)展伸長以增強(qiáng)配基和互補(bǔ)物之間的接觸面，減少空間位阻，提高親和層析的結(jié)合效率。合成過程要經(jīng)過載體活化，接” 臀”、活化及連接配基等操作步驟。
目前常用的載體是瓊脂糖膠粒。它具有機(jī)械強(qiáng)度高、透性好、載體本身非特異性吸附少等優(yōu)點(diǎn)。除此以外，其他可用作載體的材料還有纖維素、葡聚糖凝膠(SePhadex)、多孔硅膠、樹脂等。但是它們都具有不同程度的非特異性吸附，因此目前使用的并不多。
本實(shí)驗(yàn)采用豬胰蛋白酶的天然抑制劑—雞卵類粘蛋白作為配基.從豬胰臟的粗提液中分離純化胰蛋白酶。雞卵類粘蛋白是一種專一性很強(qiáng)的胰蛋白酶的抑制劑，對豬和牛的膠蛋白酶有很強(qiáng)的抑制作用。而對胰凝乳蛋白酶無抑制作用。在pH7.6~8.0的范圍內(nèi)，豬或牛胰蛋白酶能牢固地吸附在雞卵類粘蛋白上，在 PH2.5~3.0的范圍內(nèi)，能從雞卵類粘蛋白上被洗脫下來。因此，采用雞卵類粘蛋白作為配基合成親和吸附劑，可以從豬胰臟的粗提液中，通過親和層析直接獲得純度很高的豬胰蛋白酶。比活力可以達(dá)1.5~2.0×104BAEE 單位/mg 酶蛋白，相當(dāng)5次重結(jié)晶的胰蛋白酶，純化效率可提高10-20倍以上。
三、儀器、原料和試劑
器材：
紫外分光光度計(jì)、核酸蛋白質(zhì)檢測儀、高速組織搗碎機(jī)、恒溫水浴搖床、L 層析柱(10mm×100mm)、G—3玻璃燒結(jié)漏斗、酸度計(jì)、抽濾瓶。
原料
新鮮豬胰臟
試劑
1. 環(huán)氧氯丙烷，1，4—二氧六環(huán)，乙烯，乙腈，溴化氰
2. 5mol/L 硫酸;
3. 5.0mol/L 氫氯化鈉
4. 0.2mol/LpH9.5碳酸鈉緩沖液。
5. 親和柱平衡液：0.5mol/L 氯化鉀—0.05mol/L 氯化鈣-0.1mol/L，pH7.8 tris-HCl 緩沖液;
6. 親和柱洗脫液：0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液;
7. pH2.5~3.0乙酸酸化水。
8. Sepharose 4B ，雞卵類枯蛋白，純胰蛋白酶。
四、操作步驟
(一) 載體—SePharose4B 的活化
1.環(huán)氧氯丙烷活化法：
取適量的sepharose 4B，于G—3玻璃燒結(jié)漏斗(簡稱G—3漏斗)上抽去保護(hù)液。稱10g(濕重)Sepharose 4B，用100mL0.5mol/L 氯化鈉溶液淋洗，除去56Pha rose 4S 凝膠內(nèi)的保護(hù)劑，用蒸餾水洗凈，轉(zhuǎn)移到100mL 的錐形瓶內(nèi)。然后加入6.5mL 2.0moL/L 氫氧比鈉溶液、1.5mL 環(huán)氧氯丙烷、15mL 56%1，4二氧六環(huán)，于45℃的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩活化2小時。然后將活化的凝膠轉(zhuǎn)移到G3漏斗內(nèi)抽干，用蒸餾水洗至pH8.0左右，再用20mL 0.1mol/L，pH9.5碳酸鈉緩沖液淋洗。處理完畢后立即偶聯(lián)。
2.溴化氰活化法：
稱取10g Sepharose 4B(濕重)，凝膠處理方法與1相同，把SePharose 4B 凝膠轉(zhuǎn)移到一個100mL 的燒杯中(以下操作步驟必須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行)。加入15mL 0.2mol/LpH10.0的碳酸鈉緩沖液，然后將燒杯放置冰浴中，用電磁攪拌器慢慢攪拌。戴上膠皮手套，小心稱取3g 溴化氰，加入3mL 乙腈將溴化氰溶解。
取一支滴管向燒杯內(nèi)滴加溴化氰使它與Sepharose 4B 反應(yīng)，同時取另一支滴管向燒杯內(nèi)滴加6mol/L 的氫氧化鈉.使反應(yīng)體系的pH 值保持在pH10.0左右(在酸度計(jì)上校正)，待溴化氰加完以后繼續(xù)攪拌，反應(yīng)5分鐘。此時反應(yīng)體系的pH 值不再下降，仍維持在pH10.0左右，停止反應(yīng)。迅速轉(zhuǎn)移到G3漏斗內(nèi)抽濾，抽濾瓶內(nèi)應(yīng)預(yù)先加入一定量的固體硫酸亞鐵，以破壞濾液中未反應(yīng)的溴化氰。用 200mL 預(yù)冷的蒸餾水淋洗，最后浸泡在20mL 0.1mol/LpH9.5，碳酸鈉緩沖液中，處理完成后立即偶聯(lián)。
3.配基—雞卵類粘蛋白的偶聯(lián)：
將已經(jīng)活化處理好的Sepharose 4B 轉(zhuǎn)移到一個50mL 的錐形瓶內(nèi)。然后取I0mL0.1mol/L，pH 9.5的碳酸鈉緩沖液將約150mg 的雞卵類粘蛋白溶解，取出0.1mL 蛋白溶液稀釋30倍，在紫外分光光度儀上測定A280。根據(jù)消光系數(shù)A=4.13計(jì)算出偶聯(lián)前的蛋白含量。再將9.9mL 蛋白溶液加入到盛有活化Sepharose 4B 的三角瓶內(nèi)，混勻，在40-45℃的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩偶聯(lián)20-24小時左右，終止偶聯(lián)。
將凝膠轉(zhuǎn)移到G3漏斗內(nèi)，用100mL 0.5mol/L 的氯化鈉溶液抽濁、淋洗，以除去未被偶聯(lián)的雞卵類粘蛋白。取一個干凈的抽濾瓶收集濾波，測定濾液A280，計(jì)算出末被偶聯(lián)蛋白的量，然后用100mL的蒸餾水洗，用50mL 0.1mol/L 甲酸-0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5甲酸混合液洗，最后用蒸餾水洗至約pH6.5即可。將凝膠轉(zhuǎn)移至50mL小燒杯內(nèi)，用30mL 0.5mol/L氯化鉀—0.05mol/L氯化鈣0.1mol/L、pH7.8Tris—HCL 緩沖液浸泡20分鐘。脫氣后裝柱或置4℃冰箱保存。
(二) 胰蛋白酶粗操液的制備
取50g 豬新鮮胰臟(除去脂肪和結(jié)締組織)剪碎置于高速組織搗碎機(jī)內(nèi)，加入200mL預(yù)冷的pH2.5~3.0的乙酸酸化水，勻漿。于10℃提取4小時以上，4層紗布過濾，收集濾液并用5mol/L 的氫氧化鈉調(diào)至PH8.0，加入終濃度為0.1mol/L 氯化鈣及1~2mg 胰蛋白酶晶種，置4℃激活12~16小時或在室溫(25℃左右)激活2~4小時。待胰蛋白酪比活達(dá)到1000~1500 BAEE 單位/mg 以后，用6mol/L 硫酸調(diào)至pH3.0停止激活。
放置4℃冰箱內(nèi)備用。測定胰蛋白酶活性。
(三)親和層析純化胰蛋白酶
取一支層析柱(10mm×100mm)，裝入少量親和柱平衡液(0.5mol/L 氯化鉀—0.05mol/L 氯化鈣0.1mol/L，pH7.8 Tris—HCl 緩沖液)，將親和吸附劑一次裝入柱內(nèi)，待親和吸附劑自然沉降至約1/2總體積后，調(diào)節(jié)合適的流速。用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質(zhì)檢測儀檢測流出液.待基線達(dá)到穩(wěn)定后即可。
取一定體積的蛋白酶粗提液(30-50mL，視酶液的蛋白濃度及比活而定)調(diào)至pH8.0.用濾紙過濾，取濾液上柱吸附，然后用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質(zhì)檢測儀檢測流出液，待基線達(dá)到穩(wěn)定后改用親和柱洗脫液(0.1mol/L 甲酸—0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液)洗脫。收集洗脫峰2，測定酶蛋白含量及活性，
層析圖譜，如圖3—9。
圖3—9 親和層析純化胰蛋白酶洗脫曲線
平衡液：0.5mol/L 氯化鉀，0.05mol/L 氯化鈣，0.1mol/L，pH7.8Tris-HCl 緩沖液。
洗脫液：0.1mol/L 甲酸，0.5mol/L 氯化鉀，pH2.5混合液。
(四) 胰蛋白酶的保存
經(jīng)親和層析分離得到的胰蛋白酶，一般是比較純的酶，但是酶蛋白的濃度往往很低。通常可用pH5.0的乙酸透析除去溶液中的無機(jī)鹽，然后冰凍干燥成粉末，長期保存。也可將酶溶液放在-20℃的冰箱冰凍保存或者在4℃，pH3.0的酸性溶液中保存，可保存兩年左右。
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