粘多糖－肝素鈉效價的測定
一、實驗目的
1.加深了解熟悉粘多糖的化學性質。
2.掌握肝鈉素的測定原理和方法。
二、實驗原理
肝素是一種粘多糖，其多肽鏈帶有許多陰離子基團，如羧基、磺酸基等，使肝素具有強的負電荷性，能與陽離子和帶正電荷的分子結合成復合物。肝素可以與Na + 結合生成肝素鈉，具有抗血凝功能。其功能性效價的測定有兩種方法：生物鑒定法和天青A 比色法。本實驗采用后一種方法對肝素鈉效價的測定。
堿性染料天青A 的正電荷與肝素磺酸基、羧基負電荷結合，生成肝素－天青復合物，其顏色不同于原來的顏色，在pH8.6條件下，于505nm 處可進行比色測定。天青A 比色法操作簡單，重復性好，適于粗制品的快速測定。
三、 儀器 和試劑
儀器
722型分光光度計、分析天平、pH 計、容量瓶、移液管、試管等。
試劑
1.巴比妥緩沖液：稱取4.12g 巴比妥鈉，加蒸餾水到500mL，再加19mL0.2mol/L 鹽酸，混勻后制成pH8.6的緩沖液。冰箱保存待用。
2.肝素標準液：準確稱取一定量的肝素標準品，用蒸餾水配成100單位/mL，冰箱保存。測定時，取2.5mL 稀釋到250mL，成為1單位/mL。
3.天青A 溶液：稱取0.5g 天青A，先用少量蒸餾水使其完全溶解，再用水定溶到500mL，冰箱保存。臨用前取5mL，蒸餾水稀釋到25mL，混均，測定用。
四、操作步驟
(一)標準曲線的制作
取12支15mL 的試管，編號后按下表配比依次加樣并作平行管。
加完樣品、 試劑 后立即搖勻，于722分光光度計上測定A505，以0號管作空白對照。以肝素鈉效價為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。
(二)樣品測定
精確稱取10～15g 待測樣品，先用少量 蒸餾 水使其完全溶解，再加水使成1mg/mL 溶液。取2.5mL， 蒸餾 水稀釋到250mL，混均，使成1mg/100mL 的測定液。吸取0.2～1.2mL 測定液，加水補足至2mL，依次加入巴比妥緩沖液2mL，天青A 溶液0.5mL，搖勻于722 分光光度計 上測定A505。
五、計算
從標準曲線上查相應的效價，并按下式計算樣品的效價。
樣品的效價 ＝ P 1 ×V/V 1 ×S w
P 1 —待測樣品A505在標準曲線上所對應的效價單位數；
V—待測樣品總體積(mL)；
V 1 —測定時所用待測液體積(mL)；
S w —待測樣品稱取量(mg)。
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