基因剔除
當(dāng)基因轉(zhuǎn)入破壞生物體基因組內(nèi)某個(gè)基因后，觀察由此引起的表型變化，同樣也可認(rèn)識(shí)基因的功能，這是基因剔除(gene knock-out)?；蛱蕹怯?/span>DNA重組技術(shù)剔除或破壞生物體基因組內(nèi)某一特定基因，而后觀察由此引起的表型改變。這樣，可以了解該基因的生物學(xué)功能。現(xiàn)以小鼠為例，先將待剔除的基因制成缺失突變型，在缺失的位置上插入一個(gè)選擇基因如新霉素抗性基因(neo)，同時(shí)再接上另一個(gè)選擇基因如胸苷激酶基因(tk)。將這一段帶有已失去原有功能的待剔除基因的DNA片段裝在載體上，轉(zhuǎn)入在體外培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES cells)。在細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)同源重組將基因組里有功能的待剔除基因置換掉，也就是被剔除了。因?yàn)檗D(zhuǎn)入的外源DNA片段只有通過(guò)同源重組整合進(jìn)基因組時(shí)，方能把片段上連接在待剔除基因旁邊的選擇基因丟掉。非同源重組也就是隨機(jī)整合，則會(huì)把整個(gè)外源DNA片段包括已失去功能的待剔除基因序列和兩個(gè)選擇基因，全部插入ES細(xì)胞的基因組。此時(shí)，在體外培養(yǎng)ES細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)液里加入針對(duì)兩個(gè)選擇基因的適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)物質(zhì)，就可使隨機(jī)整合(此時(shí)整個(gè)外源DNA包括neo和tk基因都被整合)而仍保留著待剔除基因的ES細(xì)胞被選擇性地殺死；只有發(fā)生了同源重組(此時(shí)，tk基因不被整合)使待剔除基因被置換或剔除掉的ES細(xì)胞，方能選擇性地存活下來(lái)。然后將這些存活的ES細(xì)胞注射進(jìn)小鼠早期胚胎。由于ES細(xì)胞是二倍體細(xì)胞，所以已經(jīng)剔除了待剔除基因的ES細(xì)胞是該基因的雜合子，也就是ES細(xì)胞的一對(duì)同源染色體中只有一條染色體上的等位基因被剔除了。所以這種ES細(xì)胞注入小鼠胚胎后產(chǎn)下的小鼠也是該基因的缺失雜合體，需要把同是該基因缺失雜合體的雌雄小鼠交配，從子代中選出該基因缺失的純合體，其概率為四分之一。這些缺失純合小鼠可用于研究鑒定被剔除基因的生物功能。
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