氨基酸分離與鑒定－－雙向層析法

目的要求

（1）學習雙向紙層析的原理。

（2）掌握紙層析法分離混合氨基酸的操作方法。

實驗原理

紙層析是以濾紙作支持物，用一定的溶劑系統展開，使混合樣品達到分離分析的層析方法。其一般操作是將樣品溶解在適當溶劑中，點樣在濾紙的一端；再選用適當的溶劑系統，從點樣的一端通過毛細現象向另一端展開，展開完畢，取出濾紙晾干或烘干，再以適當的顯色劑或紫外燈、熒光燈下觀察其圖譜。樣品經展開后某一物質在紙層析譜上的位置常用比移值Rf 來表示。

Rf=

紙層析可看作是溶質（樣品）在固定相與流動相之間的連續抽提，由于溶質在兩相之間的分配系數不同而達到分離。一定的物質在兩相間有固定的分配系數，因而在恒定條件（液劑、PH、溫度）下，各物質有固定的Rf 值，據此可達到分析鑒定的目的。

由于濾紙纖維可吸收20～25%的水分；且其中6～7%以氫鍵形式與纖維素上羥基結合，一般條件下難脫去；所以紙層析實際上是以水相作固定相，展開的溶劑作流動相。

紙層析操作按溶劑展開方向可分為上行、下行和徑向三種。氨基酸分離一般用上行法。上行法又分單向（成分較為簡單的樣品）和雙向（單向時斑點重疊分離不開，于是在其垂直方向用另一種溶劑系統展層）。雙相層析譜可分辨十幾種以上的樣品。

層析溶劑要求：

（1）被分離物質在該溶劑系統中Rf 在0.05～0.8之間，各組分之Rf 值相差最好能大于0.05，以免斑點重疊。

（2）溶劑系統中任一組分與被分離物之間不能起化學反應。

（3）被分離物質在溶劑系統中的分配較恒定，不隨溫度而變化，且易迅速達到平衡，這樣所得斑點較圓整。

本實驗采用八種混合氨基酸為樣品，用酸性和堿性兩種溶劑進行雙向層析，以茚三酮為顯色劑，可獲得分離清晰的層析圖譜，如圖3.2所示。

試劑和器材

一、試劑

0.1%（W/V）茚三酮丙酮液。

溶劑系統：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；

第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。

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