DNA重組（限制性酶切和連接）
學(xué)習(xí)目標(biāo)：學(xué)習(xí)和掌握重組DNA的酶切、連接以及鑒定重組子的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。
學(xué)習(xí)內(nèi)容：質(zhì)粒DNA和目的DNA的酶切、 瓊脂 糖凝膠電泳、質(zhì)粒DNA和目的DNA的連接、感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組DNA的轉(zhuǎn)化、重組子的篩選。
學(xué)習(xí)任務(wù)與要求：課前預(yù)習(xí)、課后總結(jié)；認(rèn)真完成每一步實(shí)驗(yàn)操作，詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果并加以分析。
實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排表：
| 時(shí) 間 | 實(shí) 驗(yàn) 內(nèi) 容 |
| 第一天：8:00-8:30 | 準(zhǔn)備限制性酶切反應(yīng)體系 |
| 8:30-10:30 | 370C酶解3小時(shí) |
| 10:30－13:00 | 純化酶切載體和目的基因 |
| 13:00-14:00 | 瓊脂 糖凝膠電泳 |
| 14:00-14:30 | 準(zhǔn)備連接反應(yīng)體系 |
| 14:30－第二天8:00 | 140C連接過夜 |
| 16:30－第二天8:00 | 預(yù)培養(yǎng)過夜 |
| 第二天：8:00-8:30 | 將過夜培養(yǎng)的菌液接入新的LB培養(yǎng)基中 |
| 8:30－11:30 | 菌液培養(yǎng)2.5－3小時(shí) |
| 11:30-12:30 | 菌液冰浴保存、午飯 |
| 12:30-14:00 | 感受態(tài)細(xì)胞的制備 |
| 14:00-15:00 | 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 |
| 15:00-17:00 | 復(fù)蘇、鋪Amp抗性平板、復(fù)蘇細(xì)胞涂平板和培養(yǎng)過夜 |
| 第三天早晨8：00 | 觀察結(jié)果（抗性平板上生長起來的菌體） |
| 16:30－第二天8:00 | 預(yù)培養(yǎng)過夜 |
| 第四天：8:00-11:30 | 質(zhì)粒DNA的提取 |
| 12:00－15:00 | 質(zhì)粒DNA的雙酶切 |
| 15:00－16:30 | 瓊脂糖凝膠電泳、觀察結(jié)果 |
實(shí)驗(yàn)的常見問題、關(guān)鍵問題及難點(diǎn)：
微量操作、酶切體系的合理性、酶切是否完全、連接效率和轉(zhuǎn)化效率、感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量
可能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
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上圖顯示了不同同學(xué)的藍(lán)白斑篩選結(jié)果。只有轉(zhuǎn)入了外源質(zhì)粒的菌株才可以在含有Amp的培 養(yǎng)基上生長，所以只要有菌落生長，無論是白斑和藍(lán)斑都說明轉(zhuǎn)化是成功的。但白斑不一定就是陽性重組子，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中將生色底物x-gal涂于培養(yǎng)基表面，并 不能保證每個(gè)區(qū)域都涂滿了x-gal，沒有生色底物的地方不管是陽性還是陰性菌落都不會顯藍(lán)色，所以有一部分的白色菌落是假陽性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
上圖顯示了將白斑小提質(zhì)粒后的電泳鑒定結(jié)果。圖1和圖2是不同的同學(xué)的篩選結(jié)果。圖的上 半部分為提取質(zhì)粒后直接電泳結(jié)果，下半部分為進(jìn)行了雙酶切后的電泳結(jié)果。從圖中可以看出不進(jìn)行酶切前重組質(zhì)粒由于分子量較大而電泳遷移率較小。而雙酶切 后，由于重組質(zhì)粒會被酶切成外源基因與質(zhì)粒兩個(gè)分子所以電泳時(shí)會有兩條帶，而非重組質(zhì)粒則只有一條帶。
造成重組失敗的原因主要有：
（1）質(zhì)粒酶切不完全。雖然我們在酶切質(zhì)粒后會電泳鑒定一下質(zhì)粒是否變成單一的線性分子，但如果質(zhì)粒只被單一的酶切開我們在電 泳時(shí)看到的也是線性的分子，而在連接時(shí)我們無法將帶有單一切口的質(zhì)粒與外源基因相連，質(zhì)粒本身卻可以重新連接成環(huán)型分子，并沒有重組。
（2）連接反應(yīng)失 敗，外源基因不能與質(zhì)粒分子重組成新的質(zhì)粒分子。
（3）轉(zhuǎn)化不成功。可以做一個(gè)轉(zhuǎn)化空載體的對照實(shí)驗(yàn)消除這方面的因素。
（4）極少數(shù)情況下發(fā)生外源基因之 間或質(zhì)粒之間串聯(lián)。
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