質粒DNA的小量制備
（一）細菌的收獲和裂解
１．收獲
１）將2ml含相應抗生素的LB加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養過夜。
２）將1.5ml培養物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養物貯存于4℃。
３）吸去培養液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
３．煮沸裂解
該法根據Holmex和Quigley(1985)的方法改進而成。
１）將細菌沉淀[收獲細菌和步驟３）所得]重懸于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaC
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩３秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發揮作用。
３）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。
４）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。
５）用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置５分鐘。
７）用微量離心機于4℃以12 000g離心５分種，回收核酸沉淀。
８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。
９）加1ml７０％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
10）按步驟８）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發殆盡，管內無可見的液體（２－５）分鐘。
11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
i．當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能完全滅活內切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時）質粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。
ii．此法制備的高考貝數質粒（如Ｘf3哉pUC），其產量一般約為：每毫升原細菌增減物３－５μg。
iii．如果要通過限酶切割反應來分析DNA，可取１μlDNA溶液加到另一個含８μl水的微量離心管內，加１μl 10x限制酶緩沖液和１單位所需限制酶，在適宜溫度溫育１－２小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。通過凝膠電泳分析經限制酸消化的DNA片段。如果小量制備的DNA不被限制酶切開，很有可能在收獲細菌的步驟３）或上述步驟８）未能很好地去除所有液體。這種情況下，可用酚：氯仿抽提DNA終產物，然后用乙醇重新沉淀DNA，通常，用5－10倍過量的酶（特別是并不昂貴的酶）在100-200μl 體積中進行消化，可以克服限制酶切割反應遇到切割反應遇到的困難。消化后， 加0. 1 體積3mol/L乙酸鈉（pH5.2)和２倍體積乙醇沉淀DNA。
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