凝膠層析法分離蛋白質(zhì)

一．目的
1．了解層析技術(shù) 的基本原理；
2．初步掌握分子 篩層析的原理和操作方法。

二．原理
介紹層析的概念
所謂層析，就是利用樣品中各組成成分的理化性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相兩相中，由于各組分隨流動相前進的速率不同，從而把它們分離開來的技術(shù)。這些物理特性包括分子的大小、形狀、所帶電荷、揮發(fā)性、溶解性及吸附性質(zhì)等。層析系統(tǒng)的必要組分有：

a. 固定相，可以是一種固體、凝膠或固定化的液體

b. 層析床，把固定相填入一個玻璃或金屬柱中，或者薄薄涂布一層于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纖維紙上。

c. 流動相，起溶劑作用的液體或氣體

d. 運送系統(tǒng)，用來促使流動相通過層析床。

e. 檢測系統(tǒng)，用于檢測試管中的物質(zhì)。

由于不同物質(zhì)固定相相互作用的強弱不同，從而使得分離目的得以實現(xiàn)。
要點：層析系統(tǒng)中，與固定相作用強的物質(zhì)受到的阻力最大，而作用弱的物質(zhì)受到的阻力很小，因而不同物質(zhì)在層析過程中的遷移距離和洗脫時間不同。

介紹凝膠層析的概念。凝膠層析又稱分子篩層析，主要根據(jù)混合物中分子的大小和形狀不同 ，在通過凝膠時，分子的擴散速率各異而達(dá)到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子 易進入凝膠網(wǎng)孔，流程長而移動速度慢，而大分子物質(zhì)不能進入凝膠網(wǎng)孔，沿凝膠顆粒間隙流動，流程短移動快。這種現(xiàn)象稱為分子篩效應(yīng)。

在凝膠層析中常用的凝膠有葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel-P)和瓊脂糖凝膠(Agarose)。葡聚糖凝膠是由細(xì)菌葡聚糖(又稱右旋糖苷)在糖的長鏈間用交聯(lián)劑1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。在合成時，調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例，可以獲得具有網(wǎng)孔大小不同的凝膠。G值表示交聯(lián)度，G值愈大，交聯(lián)度愈小，網(wǎng)孔和吸水量越大。

本實驗通過SephadexG50層析柱，以蒸餾水為洗脫劑，分離血紅蛋白(紅色，分子量約64500)與硫酸銅(藍(lán)色，分子量249.5)的混合物，從顏色的不同可觀察到血紅蛋白洗脫快，硫酸銅洗脫較慢。

三．材料

1．儀器 層析柱(直徑0.8-1.5cm，長10-20cm)；吸管；玻璃棒；小燒杯；25ml量筒；試管。
2．試劑 Sephadex G-50；抗凝血； 0.9%NaCI溶液；硫酸銅溶液

四．方法
（一）凝膠的準(zhǔn)備。由準(zhǔn)備室制備。
（二）樣品制備

1．血紅蛋白(Hb)溶液的制備 取抗凝血液約0.5ml于離心管中，離心5分鐘(2500rpm)，棄去上層血漿，用0.9%NaCI溶液3ml洗血細(xì)胞二次，將血細(xì)胞用1.5ml蒸餾水稀釋，即為Hb稀釋液，備用。

3．取Hb稀釋液與CuSO4溶液各0.5ml，充分混勻，此混合液作為樣品。

（三）裝柱 取層析柱(直徑0.8-1.5cm，長度20cm)一支，將層析柱燒結(jié)板下端的死區(qū)用蒸餾水充滿，不得留有氣泡，然后關(guān)閉層析柱的出口。將已溶脹的凝膠懸液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝膠沉積1-2cm時，再打開出口，繼續(xù)加入凝膠懸液至凝膠層積集至約15cm高度即可。凝膠懸液盡量一次加完，以免出現(xiàn)不均勻或分層的凝膠帶。如表層凝膠凸凹不平時，可用玻棒輕輕攪動，讓凝膠自然沉降，使表面平整。

（四）加樣與洗脫：加樣時先將柱的出口打開，讓蒸餾水逐漸流出，待床面上只留下極薄的一層蒸餾水時，關(guān)閉出口。用滴管將樣品(約0.4ml)小心地加到凝膠床的表面上。注意加樣時不要將床面沖起，亦不要沿柱壁加入。然后，打開出口，使樣品恰好進入床面(不要讓空氣進入床內(nèi))，用上法滴加1-2倍樣品體積的蒸餾水，待完全流進床內(nèi)后，再加蒸餾水進行擴展洗脫，直至兩條區(qū)帶分開為止。

注意事項：洗脫的過程中，應(yīng)不斷滴加蒸餾水，使始終凝膠床的上表面保留約2cm左右的蒸餾水

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