細胞低溫凍存標準化實驗 Protocol｜完整實操步驟詳解

一、實驗準備

試劑準備

• PBS（磷酸鹽緩沖液）

• 完全培養基（基礎培養基 + 10% FBS + 1%雙抗）

• FBS（胎牛血清）

• 0.25% 胰酶（含EDTA或不含，視細胞類型而定）

• DMSO（二甲基亞砜，細胞凍存級）

耗材準備

• 無菌50 mL、15 mL離心管

• 無菌凍存管（推薦2 mL規格，液氮專用）

• 移液槍及對應無菌槍頭

• 程序降溫盒（如異丙醇凍存盒）

• 封口膜、Marker筆

• 細胞計數板或自動計數儀

儀器準備

• 離心機

• -80℃冰箱

• 液氮罐

• 倒置顯微鏡

操作臺準備

• 紫外照射30 min，通風10 min，確保超凈臺處于無菌狀態。

二、實驗步驟

1. 配制凍存液

• DMSO在稀釋時會明顯放熱，因此凍存液需提前配制并冷卻，保存于4℃冰箱，隨用隨取。

• 推薦配方：50% FBS + 40% 基礎培養基（含1%雙抗，不含FBS）+ 10% DMSO。
  以配制50 mL為例：取25 mL FBS、20 mL基礎培養基（含雙抗）、5 mL DMSO，于50 mL無菌離心管中混勻。

• 在管壁清晰標注：凍存液名稱、配制日期、配制人，4℃避光保存，建議現配現用。

2. 細胞消化
① 取對數生長期、密度約80%–90% 的細胞。棄舊培養基，沿培養皿側壁緩慢加入2 mL PBS，輕柔洗滌2–3次，棄去PBS。
② 向皿中央加入1 mL胰酶（以10 cm皿為例），輕晃鋪勻后置于37℃培養箱消化約2 min。
③ 鏡下見細胞變圓、輕拍即脫落時，加入3 mL完全培養基終止消化。用移液槍輕柔吹落細胞，轉移至15 mL離心管。
④ 1200 rpm 離心5 min，棄上清，收集細胞沉淀。

3. 細胞計數與分裝
① 在凍存管身用防凍Marker筆注明：細胞名稱、代數、凍存日期、操作人。
② 用預冷凍存液（1–2 mL）重懸細胞沉淀，輕柔吹打至均勻的單細胞懸液。
③ 取10 μL懸液進行細胞計數，補加凍存液將細胞密度調整為 1×10?–1×10? 個/mL。
④ 將細胞懸液分裝至凍存管，每管加入1 mL（2 mL凍存管勿裝過滿），擰緊管蓋，必要時用封口膜加固。

4.程序降溫與凍存
推薦方法：將凍存管放入程序降溫盒（確認異丙醇液面及溫度），直接放入-80℃冰箱過夜（至少4小時），次日轉移至液氮罐中長期保存。
無程序降溫盒時：采用梯度降溫——
　? 4℃ 放置 30 min
　? -20℃ 放置 1–2 h
　? -80℃ 過夜
　? 移入液氮罐長期儲存

1. 慢凍速融原則：凍存時緩慢降溫，使細胞充分脫水，避免胞內形成冰晶；復蘇時則需在37℃水浴中快速融化，減少冰晶重結晶損傷。

2. 凍存液使用：需4℃預冷，隨用隨取，不可預熱。DMSO在室溫下對細胞有一定毒性，操作應迅速輕柔。

3. 細胞質量控制：凍存前確保細胞狀態良好，活率≥90%，無支原體污染。

4. 凍存安全：一定要使用液氮專用凍存管，防止液氮滲入導致炸管；從液氮中取管時務必佩戴防凍手套和護目鏡。

5. 信息記錄：建立凍存庫臺賬，記錄細胞位置、代數、凍存日期等信息，并定期檢查液氮液位，及時補充。

6. 凍存液保存：建議現配現用，4℃保存不宜超過1個月；若出現沉淀或顏色改變則丟棄。