無菌實驗怎么做？

一、什么是無菌實驗

無菌實驗，也稱為無菌檢查法，是一種用于檢測藥品、醫療器械、生物制品、原料、輔料及其他特定物品是否存在活的微生物的微生物學檢驗方法。

二、無菌實驗的原理

無菌實驗主要的方法有薄膜過濾法和直接接種法兩種，均要求在無菌條件下進行，試驗環境必須達到無菌檢查的要求，檢驗全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。

薄膜過濾法適用于液體供試品，非液體供試品需要用稀釋液配制成液體或者用沖洗液沖洗后測試液體提取液。然后將液體供試液用≤0.45μm的濾膜過濾，將濾膜進行培養；

直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品，取一定量的供試品與培養基中進行培養；

在特定的溫度下培養14天，培養期間要定期觀察并記錄是否有菌生長。

三、實驗前準備

1、環境要求

必須在B級背景下的A級單向流空氣區域（如超凈工作臺或隔離器） 中進行。這是最關鍵的條件，確保操作區域的無菌。

2、人員培訓

操作人員必須經過嚴格的無菌操作培訓。

3、培養基準備

流體硫乙醇酸鹽培養基（FTM）： 用于培養需氧菌和厭氧菌。

胰酪大豆胨液體培養基（TSB）： 用于培養需氧菌和真菌。

培養基必須通過無菌性檢查和適用性檢查，確認其本身無菌且能支持微生物生長。

4、器材滅菌

所有涉及到的實驗器材，如移液管、吸頭、剪刀、鑷子、培養皿等，都必須經過高壓蒸汽滅菌。

5、消毒

用合適的消毒劑（如75%酒精）對工作臺面、操作人員手部以及待檢樣品的外包裝進行徹底消毒。

四、薄膜過濾法

薄膜過濾法是首選和最常用的方法，適用于可溶于水、油性或混懸液等絕大多數液體樣品，以及無菌器械的沖洗液。

1、將樣品用適當的稀釋液（如pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）溶解或稀釋。

2、在無菌條件下，將樣品溶液倒入無菌過濾裝置中，啟動真空泵進行過濾。

3、過濾完成后，用稀釋液沖洗濾膜，以去除可能抑制微生物生長的產品成分（如抗生素）。

4、將濾膜小心取出，分別放入含FTM和TSB的培養容器中（或直接向過濾裝置內注入培養基）。

五、直接接種法

直接接種法適用于溶解度好、無抑菌性或抑菌性很弱的樣品。操作簡單，但靈敏度不如薄膜過濾法。

在無菌條件下，將規定量的樣品直接加入盛有培養基的容器中。通常每支培養基接種的樣品量不應超過培養基體積的10%，以確保培養基的稀釋作用能消除產品的抑菌性。

薄膜過濾法和直接接種法的區別詳細見下表：

六、培養與觀察

1、分組

供試品組：接種了樣品的培養基。

陽性對照組：在培養基中加入小于100 CFU的已知陽性菌（如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉），以證明培養基確實能檢測出微生物。此操作必須在單獨的實驗室進行，以免污染供試品和環境。

陰性對照組：未接種樣品和菌液的培養基，用于確認實驗過程中培養基始終無菌。

2、培養條件

FTM培養基： 通常在30-35℃下培養不少于14天。用于厭氧菌的FTM培養管在上層液面以下。

TSB培養基： 通常在20-25℃下培養不少于14天。

3、觀察記錄

在培養期間的第3、5、7、14天定期觀察并記錄是否有微生物生長跡象（如渾濁、產氣、形成菌膜或沉淀）。應使用陽性對照作為生長參照。