原代細(xì)胞的復(fù)蘇步驟

　　細(xì)胞一般儲(chǔ)存在液氮中，溫度達(dá)-196℃，理論上儲(chǔ)存時(shí)間是無限的。細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。

　　細(xì)胞復(fù)蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著的細(xì)胞恢復(fù)到一般的生長(zhǎng)狀態(tài)，今天我們來看看原代細(xì)胞的復(fù)蘇步驟。

　　一、檢查

　　收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即處理告訴寄方。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開始培養(yǎng)，或立即冷凍保存(置于–70 °C，隔夜后，移到液氮罐保存)。

　　二、冷凍細(xì)胞解凍　

方法一：

1、準(zhǔn)備好37度水浴鍋，預(yù)熱至37度；

2、準(zhǔn)備好T25培養(yǎng)瓶，加入10ml完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)基量必須大于凍存液10倍體積）；

3、取出凍存細(xì)胞管，用一次性PE手套包裹凍存管（防止管內(nèi)進(jìn)水導(dǎo)致污染），迅速放于水浴鍋內(nèi)，于1min內(nèi)融化完全；

4、取出凍存管，酒精噴灑消毒后擦干，置于超凈臺(tái)內(nèi)；

5、吸取凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液，加入步驟2中準(zhǔn)備好的T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，8字緩慢搖勻；

6、培養(yǎng)瓶放于37度CO₂恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)24h，更換新鮮換培養(yǎng)基（注意貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞不同操作方法）。

方法二：

1、準(zhǔn)備好37度水浴鍋，預(yù)熱至37度；

2、準(zhǔn)備好15ml無菌離心管，加入10ml完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)基量必須大于凍存液10倍體積）；

3、準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)板或培養(yǎng)器皿；

4、取出凍存細(xì)胞管，用PE手套包裹凍存管（防止管內(nèi)進(jìn)水導(dǎo)致污染），迅速放于水浴鍋內(nèi)，于1min內(nèi)融化完全；

5、取出凍存管，酒精噴灑消毒后擦干，置于超凈臺(tái)內(nèi)；

6、吸取凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液，加入步驟2中準(zhǔn)備好的15ml無菌離心管，輕輕吹打混勻；

7、將離心管內(nèi)細(xì)胞懸液，按實(shí)驗(yàn)需求接種于實(shí)驗(yàn)器皿內(nèi)（注意接種密度不低于2×10⁴/cm²），放于37度CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置培養(yǎng)24h，更換新鮮換培養(yǎng)基（注意貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞不同操作方法）。　　

　　三、細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

1、整個(gè)復(fù)蘇過程要盡量快，溶解時(shí)間太長(zhǎng)可能影響復(fù)蘇效果；

2、已溶解的凍存細(xì)胞盡量短時(shí)間的在常溫存放，盡快稀釋或者離心去除DMSO；

　　3、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大，尤其是液氮里拿出來的凍存管，放到水里可能會(huì)造成翻江倒海的既視感，所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁，這樣即使有炸裂的情況也會(huì)有水做緩沖；

　　4、取凍存管時(shí)要謹(jǐn)防凍傷，尤其是夏天，盡管熱也最好穿長(zhǎng)袖白大褂；

　　5、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進(jìn)行，也就是直接把凍存管離心，離心后棄去原來的凍存液，然后直接加完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接著把細(xì)胞轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿/瓶里培養(yǎng)。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈，但是基本影響不大；

　　6、復(fù)蘇第二天記得去看看細(xì)胞，如果狀態(tài)還不錯(cuò)的話就說明復(fù)蘇成功。

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