果實菠蘿蛋白酶的動力學測定
一、目的
酶是生物細胞產生的以蛋白質為主要成分的生物催化劑。酶催化生物體內各種化學反應有條不紊的高效進行。酶促反應動力學研究各種因素對反應速度的影響，包括底物濃度、酶濃度、抑制劑的種類和濃度、pH 和溫度等。最基本的動力學關系是底物濃度對酶促反應速度的影響。在無抑制劑的最簡情況下，米一曼方程正確地描述了這種動力學關系：
反應速度v 和底物濃度[S]有一一對應的關系，要深刻認識某種酶，關鍵是通過實驗測定其最大反應速度V max 和米氏常數K m 。通過對米一曼方程變形，可找到4 種方法，通過作圖求得V max 和K m 。其中比較常用的是Lineweaver-Burk 作圖法（雙倒數作圖法），其依據的變形方程為：
V max 。 本實驗以果實菠蘿蛋白酶粗制品為實驗材料，先用離子交換柱層析純化該酶，再通過時間進程曲線、酶活性、蛋白質含量測定，求得K m 值，加深對酶活性、比活蛋白質純化的認識，掌握酶動力學測定的一般原理和方法。
二、原理
果實菠蘿蛋白酶是一種植物巰基蛋白酶，單條肽鏈組成，含有4％的糖組分，4℃下等電點pI 為9.4，分子質量約28 100 。為了縮短提純時間，防止或減少自身降解，可采用DEAE 一纖維素離子交換層析，使其作為第一個洗脫峰被洗脫下來而得到純化。
果實菠蘿蛋白酶可將底物酪蛋白水解為能溶于三氯乙酸溶液的小肽，反應一定時間后用三氯乙酸終止酶反應，用濾液中生成的小肽使吸光度的增加值表示酶促反應速度。據此可作出酶促反應的時間進程曲線，確定反應初速度V o 的范圍。粗酶液和純化酶液的蛋白質含量可用考馬斯亮藍G-250 法測定。據此可計算酶的回收率。
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